用于产生脱唾液酸化免疫球蛋白的方法和载体的利记博彩app
【专利说明】用于产生脱唾液酸化免疫球蛋白的方法和载体
[0001] 本申请是申请日为2007年12月26日，申请号为200780051802. 3 (国际申请号为 PCT/US2007/088809)，发明名称为"用于产生脱唾液酸化免疫球蛋白的方法和载体"的发明 专利申请的分案申请。
[0002] 发明背景 发明领域
[0003] 本发明涉及产生与Fc受体相互作用的治疗蛋白质例如抗体的方法，其中寡糖链 的组成就抗体与其靶的抗体亲抗原性以及Fc受体结合亲和力进行最优化，从而与产生糖 基化抗体的非最优化方法相比较，最优化所述抗体的效应子功能活性。
[0004] 相关技术的描述
[0005] 抗体是在先天免疫中发挥显著作用的可溶性血清糖蛋白。在重链恒定区中的保 守位置处所有天然产生的抗体的碳水化合物结构都随同种型而变化。每种同种型都具有N 联寡糖结构的不同阵列，这反复不定地地影响蛋白质装配、分泌或功能活性（Wright，A.和 Morrison，S. L.，Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。参考图 1 和 2,依赖于加工程度，附着 的N联寡糖结构相当不同，并且可以包括高甘露糖，以及含或不含二等分GlcNAc和核心岩 藻糖残基的复杂双触角寡糖（Wright，A.和Morrison，S. L.，同上）。一般地，存在在特定糖 基化位点处附着的核心寡糖结构的异质加工，从而使得甚至单克隆抗体也作为多重糖形存 在。类似地，已显示抗体糖基化中的主要差异在抗体产生细胞系之间发生，并且甚至对于在 不同培养条件下生长的给定细胞系可见微小差异。
[0006] 在聚糖上的唾液酸（静止基团）已知在延长除抗体外的糖蛋白的血清半衰期中是 重要的（Stockert，R.J. (1995) Physiol. Rev. 75, 591-609)。迄今为止，唾液酸对单克隆抗 体（Mabs)的作用仍未完全了解。Mabs的血清半衰期特别长寿，并且Fc-融合蛋白的构建已 证明是在开发治疗蛋白质例如蛋白质enteracept中有用的策略。
[0007] 抗体和T细胞受体分子具有负责特异性细胞表面受体结合的区域，所述结合调节 细胞应答。在免疫系统中，这些功能分类为体液和细胞的。抗体通常称为连接体液和细胞 免疫机制的衔接分子：体液应答主要归因于能够与靶抗原高亲和力结合的成熟的、分泌的、 循环抗体。细胞应答归因于通过ab-ag复合物的结合和通过下游结局的细胞激活结果，所 述下游结局通过由于ab-ag复合物与效应细胞结合释放的细胞介质引起。这些细胞应答包 括靶的中和、调理作用和致敏作用（如果抗原展示于细胞表面上）、肥大细胞的致敏作用和 补体激活。对于细胞靶，即，细胞表面抗原，这些效应子功能导致通常所谓的抗体依赖性细 胞毒作用（ADCC)和依赖补体的细胞毒性（CDC)。
[0008] 在抗体同种型（例如，IgE、IgD、IgA、IgM和IgG)中，IgGs是最丰富的，其中IgGl 亚类显示出最显著程度和大量的效应子功能。IgGl类型的抗体是癌症免疫治疗中最常用 的抗体，在所述癌症免疫治疗中ADCC和CDC活性通常视为重要的。在结构上，IgG铰链区 和CH2结构域在抗体效应子功能中起重要作用。Fc区（由铰链、CH2和CH3结构域的二聚 化形成）中存在的N联寡糖影响效应子功能。共价结合的寡糖是复杂双触角类型结构，并 且是高度异质的（参见图1和2)。在Asn297处的保守N联糖基化位点位于每个CH2结 构域中。在成熟抗体中，与Asn297附着的2个复杂双触角寡糖包埋在CH2结构域之间，与 多肽主链形成广泛接触。已发现它们的存在对于抗体介导效应子功能例如ADCC是必需 的（Lifely，M. R.，等人，Glycobiology 5 :813_822 (1995) ; Jefferis，R.，等人，Immunol Rev. 163 :59-76 (1998) ;Wright，A?和 Morrison，S. L.，同上）〇
[0009]由各种宿主细胞产生的装饰Fc部分抗体或抗体衍生结构包含的异质寡糖占优势 地包含唾液酸、岩藻糖、半乳糖和GlcNAc残基作为末端糖（Raju，T. S.，等人Glycobiology 2000. 10(5) :477-86)。已显示这些末端糖中的一些，特别是暴露的半乳糖、核心岩藻糖和 二等分GlcNAc残基，影响分子的Fc部分的结构且由此改变抗体效应子功能。效应子功能 例如ADCC活性和CDC活性可以通过附加聚糖的组成加以改变，所述效应子功能依赖于与称 为Fc受体的细胞表面受体的结合，以及与各种配体包括Clq补体蛋白质的结合（Presta L. 2003.Curr Opin Struct Biol.l3(4) :519-25)。在Fc处附着的大多数N联聚糖未唾液酸 化至显著程度（Idusogie EE，等人 2000. J Immunol. 15:164(8) :4178_84)。
[0010] 在人IgG和其他重组产生的IgGs中发现的大多数结构是含或不含暴露的Gal残 基的复杂双触角结构（图1)。存在许多哺乳动物宿主细胞，其目前用于表达重组抗体用于 研究目的以及生物制药生产。宿主细胞起源物种以及培养条件可以引起与重组表达分子附 加的聚糖程度和结构改变。用于抗体的重组表达的2种常用宿主细胞系是中国仓鼠卵巢细 胞（CH0)和小鼠骨髓瘤细胞（sp2/0、653、NS0)。尽管CH0细胞表达几乎缺乏唾液酸聚糖的 重组抗体，但聚糖是99%岩藻糖基化的。岩藻糖的存在已显示是减少的Fc-y III受体和因 此ADCC的主要贡献者。小鼠骨髓瘤细胞表达具有最高达50%唾液酸但具有一般较少的岩 藻糖的重组抗体。如上所述，这些差异可以对体内抗体活性具有显著影响。
[0011] 因此，希望能够以这样的方式减少与治疗抗体相关的聚糖唾液酸化，所述方式消 除关于收获后加工的需要，且同时提供就唾液酸含量而言合理地同质结构。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明包含用于生产具有减少的唾液酸含量的含Fc分子特别是抗体治疗剂的方 法、宿主细胞系、以及表达载体和质粒。更具体而言，本发明包含编码工程改造的唾液酸酶 编码序列的表达质粒，所述质粒一旦整合入抗体分泌宿主细胞系内，就使得宿主细胞能够 分泌具有唾液酸酶活性的多肽。在一个实施方案中，在质粒内的编码序列编码产脲节杆菌 (Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶的催化结构域。在本发明的进一步方面，包含产脲 节杆菌唾液酸酶的催化结构域的宿主细胞将翻译的催化结构域分泌到培养基内。
[0014] 本发明包含用于控制含Fc分子的性质的方法，其包括使与Fc区附着的寡糖的唾 液酸化降到最低，由此最优化分子对于多种定位的靶蛋白质的抗体亲抗原性和对于一种或 多种Fey受体例如？〇丫1?1、？〇丫1?114和？〇丫1?1114受体的亲和力他(1：活性；巨噬细胞或 单核细胞活化；和血清半衰期。
[0015] 本发明还涉及在Fc结构域中包含最大限度的唾液酸化N联寡糖的含Fc分子例如 抗体的高度同质批次的制备。它进一步涉及就在Fc寡糖中包含唾液酸的抗体以及在Fc寡 糖中不包含唾液酸的抗体富集的抗体批次的纯化。
[0016] 附图的几个视图的简述
[0017]图1是在人IgG中发现的最大寡糖结构的示意描述。
[0018] 图2描述了在中国仓鼠卵巢（CH0)细胞中产生的重组IgG中发现的主要寡糖结 构。
[0019] 图3显示Fc寡糖的HPLC分析结果。N联寡糖首先通过用PNGase F酶处理从抗体 中释放。所释放的寡糖用邻氨基苯甲酸进行标记，并且标记的寡糖通过凝胶过滤层析进行 纯化。纯化的标记寡糖通过HPLC进行分析，导致显示的层析谱。
[0020] 图4A和4B是显示通过2种不同形式的不同Abl :TNF免疫复合物与K562细胞上 的人FcyRII结合的曲线图。（A)在与Ab6复合的固定量1251标记的人IgGl Ab5的存在 下，通过向细胞中加入各种量Abl和TNF的未标记复合物测量的竞争结合，所述Ab6是对于 Ab5特异的小鼠单克隆Ab。（B)通过向K562细胞中加入与 1251标记的TNF复合的各种量 Abl测量的直接结合。
[0021] 图5A-D是用各种测试Ab制剂的Fc y Rllla结合研究曲线图，所述制剂用于与固 定浓度的放射性标记的抗Fc y Rllla mAb 3G8竞争结合NK细胞Fc y Rllla :Abl天然糖基 化变体（A) ;Ab5天然糖基化变体（B) ;Abl凝集素柱级分（C);和Ab2凝集素柱级分（D)。
[0022] 图6A-D是显示使用在唾液酸含量中不同的Abl、在其细胞表面上超表达TNF的K2 靶细胞、和表达Fc y Rs的人PBMC效应细胞执行的体外ADCC测定结果的曲线图。（A) Ab 1天 然糖基化变体，（B)Ab2天然糖基化变体，（C)在基于WGA凝集素亲和力的分级分离后，在唾 液酸含量中不同的Abl的3个小批（sublot)与酶促去糖基化（Gno) Abl的比较，（D)未处 理的Ab 1样品与完全唾液酸化的Ab 1 G2S2样品、或Ab7同种型匹配的阴性对照Ab的比较。 样品一式三份地进行分析（误差条表示标准差），并且所显示的结果代表关于每个变体对 的3次独立实验。如通过额外平方和（extra sum of square)F检验测定的，这些测试样品 之间在活性中的差异是显著的（对于图A、C和DP < 0. 0001 ;对于图BP = 0. 0016)。
[0023] 图7A和B是显示各种IgG抗体样品与U-937细胞上的人Fc y RI (⑶64)受体的竞 争性结合的曲线图，（A) Abl G2(完全半乳糖基化和未唾液酸化的）和Abl G2S2 (hi)(完全 半乳糖基化和完全唾液酸化的）仅相差唾液酸的不存在和存在，（B)Ab3的2个不同批次在 荷电寡糖种类（含唾液酸种类）量方面不同，为总寡糖的2%或42%。
[0024] 图8是显示施用后时间和融合蛋白（FcPl)的Fc部分的血清浓度之间的关联的曲 线图，所述融合蛋白已完全唾液酸化（G2S2)或未修饰。
[0025] 图9是显示施用后时间和完全唾液酸化Ab2 G2S2、或完全脱唾液酸化的Ab2 G2的 Fc部分的血清浓度之间的关联的曲线图，通过如所述的酶促方法。
[0026] 图10A-D是显示Ab制剂中的唾液酸对细胞表面上的靶配体亲和力的作用的曲线 图，通过用放射性标记的Ab的竞争结合：(A) Abl天然变体，（b)Ab5天然变体，（C) Abl凝集 素柱级分变体，和（D)Ab2凝集素柱级分变体。样品一式两份或一式四份地进行测试，并且 所显示的结果代表3或4次独立实验。如通过额外平方和F检验测定的，在这些测试样品 之间的结合中的差异是显著的（对于图A、C和DP < 0. 0001)。
[0027] 图11A-B是显示Ab制剂中的唾液酸对EIA板上包被的靶配体亲和力的作用的曲 线图：(A)与TNF结合的Abl天然变体，（B)与抗Id抗体结合的Ab2。
[0028] 图12A-C是显示Ab制剂中的唾液酸对靶配体亲和力的作用的曲线图，所述靶配体 作为对表面结合的Ab的放射性标记的可溶性抗原存在：(A) Abl天然变体，（B) Abl 1凝集素 柱级分变体，和（C)Ab2凝集素柱级分变体。进行与放射性标记的Ag和100倍过量的未标 记Ag的平行温育，以测定非特异性结合。样品一式三份地进行测试。
[0029] 图13是构建为表达与hGH(人生长激素）信号序列连接的产脲节杆菌唾液酸酶A 的催化结构域的表达质粒P3629的示意图示，其中示出了用于克隆到亲本载体p2815内的 限制酶位点。
[0030] 图14是呈现从表达分泌的唾液酸酶催化结构域的细胞系纯化的抗体的抗体依赖 性细胞毒作用（ADCC)活性的曲线；克隆3、5、12、13和17。
[0031] 发明详述
[0032] 缩写
[0033] a 1，3GT，a-l，3_ 半乳糖基转移酶；a2,3ST，〇-2,3-唾液酸转移酶；0 1，461'， 0-1，4-半乳糖基转移酶；ADCC，抗体依赖性细胞毒作用；ATCC，美国典型培养物保藏中心； BATDA，二（乙酰氧甲基）2,2':6'，2"-三联吡啶1, 7"-二羧酸邮六，牛血清清蛋白；0)培 养基，化学成分确知培养基；⑶C，补体指导的细胞毒性；CMP-Sia，胞苷一磷酸N-乙酰神经 氨酸；DMEM，Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基；E : T，效应细胞与靶细胞比：FBS，胎牛血 清；ESI-MS，电喷射离子化质谱分析法。NK细胞，天然杀伤细胞；IgG，免疫球蛋白G ;頂DM， Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基；MALDI-T0F-MS，基质辅助激光/解吸离子化飞行时间 质谱分析法;MHX，霉酚酸、次黄嘌呤、黄嘌呤；NANA，唾液酸的N-乙酰神经氨酸同分异构体； NGNA，唾液酸的N-羟乙酰神经氨酸同分异构体；PBMC，外周血单核细胞；PBMC，外周血单核 细胞；PBS，磷酸缓冲盐水；PNGase F，肽N糖苷酶F ;RP-HPLC，反相高效液相层析；RT，室温； Sia，唾液酸；UDP-Gal，尿苷二磷酸半乳糖；UDP-GlcNAc，尿苷二磷酸N-乙酰葡糖胺。
[0034] 定义
[0035] 术语"ADCC活性"表示依赖抗体的细胞毒性，且意指通过非致敏效应细胞的抗体介 导的靶细胞破坏现象。靶细胞的特性可变，但它必须有具有能够活化Fc受体的Fc结构域 或Fc结构域部分的已结合的表面免疫球蛋白G。效应细胞是具有Fc受体的"杀伤"细胞。 它可以是例如缺乏常规B或T细胞标记的淋巴细胞，或单核细胞、巨噬细胞、或多核白细胞， 依赖于靶细胞的特性。反应是不依赖补体的。本发明的抗体或其他含Fc蛋白质的ADCC活 性得到"增强"，如果它显示ADCC介导的细胞杀伤能力超过由可替代宿主细胞产生的基本 上相似序列的抗体或蛋白质和Fc结构域的能力的话。ADCC活性可以在体内或体外细胞杀 伤标准测定中进行测定，例如本文讨论的测定。优选地，具有增强的ADCC活性的本发明的 抗体在比可替代宿主细胞中产生的参考抗体更低的剂量下和/或更短的时间中达到相同 作用（预防或抑制肿瘤细胞生长）。优选地，在本发明范围内的抗体和参考抗体效能之间的 差异是至少约1. 5倍、更优选至少约2倍、甚至更加优选至少约3倍、最优选至少约5倍，如 例如通过在所选择的标准铬释放ADCC测定中并行比较测定的。
[0036] 如本文所使用的，术语"亲和力"意指单个单价配体对于其关联结合配偶体的结合 常数的量度，例如，Fab'对于抗原或表位的结合。亲和力可以以几种方法进行测量，包括通 过例如等离振子共振（BiaCore)测量结合和解离速率（分别为MPk#)，并且表示为总体 结合（K ass)或解离常数（KD)，其中Kass是k。，。"，和KD是k。"九。K D也可以通过例如测量 在其下配体与结合配偶体的结合是半饱和的浓度凭经验进行测量。测量KD的另一种方法 是通过竞争测定，其中一种粘合剂或配体进行标记或加上标签，并且保持在恒定浓度下，而 测试粘合剂或配体以各种浓度加入，以从其关联结合配偶体中竞争走标记的物质，且测定 在其下标记减少一半的浓度。
[0037] 如本文所使用的，术语"抗体亲抗原性"意指在配体和结合配偶体可以是多价的， 并且关于多个结合和解离事件的趋势可以对于特定配体同时发生的范围内，配体保持与结 合配偶体结合的趋势的量度。因此，抗体亲抗原性可以通过具有已知亲和力的结合配偶体 的多价构象的表观亲和力中的增加进行测量。
[0038] 如本文所使用的，术语"含Fc蛋白质"或"含Fc分子"指具有配体结合结构域以 及至少免疫球蛋白CH2和CH3结构域的单体、二聚或异二聚蛋白质。CH2和CH3结构域可以 形成蛋白质/分子（例如，抗体）的二聚区域的至少部分。
[0039] 术语"抗体"意欲包含抗体、其消化片段、特定部分及变体，包括但不限于，抗 体模拟物，或包含模拟抗体或其指定片段或部分的结构和/或功能，并且保留Fc介导 的功能的抗体部分，包括但不限于：与Fc受体（例如Fc y RI (CD64) Fc y RIIA (CD32A)、 Fc y RIIIA(CD16A)和 FcRn)结合、结合补体（例如 Clq)、ADCC 和 CDC。
[0040] 如本文所使用的，术语"单克隆抗体"是特定形式的含Fc融合蛋白，其中配体结合 结构域保留与至少一个动物抗体种类的重或轻链抗体可变结构域至少之一的相当大同源 性。
[0041] 如本文所使用的，抗体或抗体类似物的"效应子功能"是通过其病原体或异常细胞 例如肿瘤细胞被破坏且从体内去除的过程。先天性和适应性免疫应答使用大部分相同的效 应机理以消除病原体，包括ADCC、CA (补体激活）、Clq结合和调理作用。
[0042] 如本文所使用的，术语"宿主细胞"指任何种类的细胞系统，其可以进行工程改造 以产生目的蛋白质、蛋白质片段或肽，包括抗体和抗体片段。宿主细胞包括但不限于，培养 的细胞，例如哺乳动物培养的细胞，例如CH0细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞或杂交瘤 细胞，酵母细胞，和昆虫细胞，但也包含在转基因动物或培养的组织内的细胞。
[0043] 术语"唾液酸"指9-碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙 酰神经氨酸（2-酮-5-乙酰氨基-3, 5-双脱氧-D-甘油基-D-半乳糖吡喃型尤罗索-1-尼克 I 酸（galactononulopyranos-1-onic I acid)(通常缩写为 Neu5Ac、NeuAc 或 NANA)。该家 族的第二个成员是N-羟乙酰-神经氨酸（NGNA、Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基 是羟基化的。这种形式在来自啮齿类动物和微生物来源的糖蛋白中是普遍的。第三个唾液 酸家族成员是2-酮-3-脱氧-尤罗索尼克酸（KDN) (Nadano等人（1986)J.Bi〇l.Chem. 261 : 11550-11557 ;Kanamori 等人，J. Biol. Chem. 265 :21811-21819 (1990))。还包括 9-取代的 唾液酸，例如9-0-C-C6酰基Neu5Ac，如9-0-乳酰基-Neu5Ac或9-0-乙酰基-Neu5Ac、9-脱 氧 _9_氟-Neu5Ac和9叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。关于唾液酸家族的综述，参见例如，Varki， Glycobiology 2:25-40(1992) ；Sialic Acids ：Chemistry, Metabolism and Function， R.Schauer，编辑（Springer Verlag，New York (1992))。
[0044] 描述
[0045] 鉴于本发明人已意外地发现Fc寡糖的唾液酸化水平改变重组产生的治疗抗体对 于Fey受体的亲和力，从而导致所述抗体生物作用的各个方面的调节。更具体而言，发现 高度唾液酸化的Abs已显著减少对于低亲和力受体Fc y RIIA(CD32A)和Fc y RIIIA(CD16A) 的亲和力，并且在其中Fc y RIIIA被认为是相关受体的体外ADCC测定中具有显著减少的活 性。进一步发现与脱唾液酸化或部分唾液酸化的含Fc蛋白质相比较，高度唾液酸化的Abs 对于高亲和力Fc y受体Fc y RI (⑶64)具有增加的亲和力，并且完全唾液酸化的含Fc蛋白 质具有减少的血清半衰期。进一步发现唾液酸从Fc寡糖中的去除（或不存在或减少水平） 增强重组产生的治疗抗体对于其靶分子的抗体亲抗原性。这些发现和支持信息已在共同未 决的美国临时申请号60/695, 769、60/809, 106、60/841，153中得到描述。
[0046] 尽管不希望受任何一种理论束缚，从寡糖中去除荷电静止基团可以解释为允许总 体抗体结构中更多的灵活度，所述灵活度对于在彼此关系中的2个结合结构域赋予扩大范 围的潜在相互作用。