一种杜仲叶提取物及其保护肝脏的医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药领域，具体涉及一种杜仲叶提取物及含有该提取物的药物制剂， 该杜仲叶提取物可以用来制备保护肝脏的药物。
【背景技术】
[0002] 杜仲叶EucommiaulmoidesOliv.属被子植物门，杜仲叶科，杜仲叶属，落叶乔木， 高达20m，树皮灰褐色，连同枝、叶、根均含胶，折断有银白色细丝。叶椭圆或椭圆伏卵型，长 6~18cm，边缘有锯齿，下边脉上有毛，叶柄长1~2cm，果为翅果扁平而薄，内含一种子。杜 仲叶作为中药在我国已有2000多年的药用历史，《神农本草经》和《本草纲目》均将其列为 上品，其具有多种功效，主要用于治疗肾虚腰痛，筋骨无力，妊娠漏血，胎动不安，高血压症。
[0003] 近年来，各国学者对杜仲叶化学成分进行了大量研究，目前分离得到并经鉴定的 有机化合物有70种以上，无机矿物元素不少于15种。研究发现，杜仲叶皮、花、叶和枝条等 各部分中含有相似的化学成分，主要包括木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类和留体类等有机化 合物。现代药理学证明，杜仲叶具有多种功能活性，如降血压、抗衰老、抗癌、抗菌、镇痛、消 炎，利尿、镇静、安神，抗病毒作用，增强机体非特异免疫力，并能对细胞免疫进行双相调节 等功效，另外对神经中枢也有一定作用。杜仲叶也因其显著的生理活性得到了众多学者的 关注。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种杜仲叶提取物，该提取物的制备方法和液相分析方 法，含有该提取物的药物制剂及利用该提取物制备保护肝脏的药物的用途。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] -种杜仲叶提取物，该提取物由以下方法制备：
[0007] (a)将干燥的杜仲叶粉碎；(b)用75%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇 味得到浓缩液；（c)对步骤（b)浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分 别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（d)正丁醇萃取物用大孔树脂富 集，先用10%乙醇冲洗8个柱体积除去多糖，再用65%乙醇洗脱10个柱体积，收集65 %洗 脱液，减压浓缩，喷雾干燥。
[0008] 进一步地，步骤（d)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。
[0009] 为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同产地、批次药材制备的杜仲叶 提取物批间差异，所述提取物的液相分析方法为：
[0010] 色谱柱：DiamonsilC18 柱（4. 6mmX250mm，5ym);
[0011] 流动相：A为乙腈，B为0. 1 %磷酸溶液（三乙胺调节pH值至6. 2);
[0012] 梯度洗脱程序：0? 01 ~70min，A20% - 80% ;
[0013] 流动相流速：1.OmL?minS检测波长：240nm;柱温：30°C;进样量：10yL。
[0014] 药物制剂，含有治疗有效量的所述杜仲叶提取物和药学上可接受的载体。
[0015] 所述的杜仲叶提取物在制备保护肝脏的药物中的应用。
[0016] 所述的药物制剂在制备保护肝脏的药物中的应用。
[0017] 本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。
[0018] 所述药物制剂含有治疗有效量的本发明杜仲叶提取物，其余为药物学上可接受 的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0019] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0020] 本发明的优点：本发明通过对杜仲叶药材进行提取、除杂、富集处理，能得到具有 保护肝脏作用的提取物；本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱， 用于控制不同产地、批次药材制备的提取物的批间差异。
【附图说明】
[0021] 图1为杜仲叶提取物HPLC液相图谱。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0023] 主要试剂和材料：杜仲叶药材购自安徽亳州中药材市场；食品级乙醇购自上海凌 峰化学试剂有限公司；医药级AB-8大孔树脂购自天津波鸿树脂有限公司；乙腈为HPLC级， 购于TEDIA;85%磷酸为HPLC级，购于TEDIA;色谱用纯净水为哇哈哈纯净水。HL7702肝 细胞株由中国科学院上海生命科学研究所提供。高糖DMEM培养基、高糖DMEM/F12 = 1:1 培养基、胎牛血清均购于HycLone。EDTA购于上海试剂一厂。台盼蓝购于北京化工厂。无 糖DMEM培养基购于Gibco。胰酶、MTT、DMS0均购于Amresco。LDH释放法检测试剂盒购于 GENMDE。ALT生化检测试剂盒、AST生化检测试剂盒、LDH生化检测试剂盒均购于美国贝克 曼试剂有限公司。Western及IP细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、MDA检测试 剂盒均购于碧云天生物研究所。
[0024]C02培养箱（SheL-Lab2300)，电热恒温孵育箱（上海跃进医疗器械厂），缺氧培 养盒（长沙长锦科技有限公司），酶标仪（美国BioTekEpoch)，全自动生化仪（Beckman LX2〇)，离心机（德国Eppendorfcentrifyge54：lf5D) 〇
[0025] 实施例1:杜仲叶提取物制备
[0026] 将10kg干燥的杜仲叶粉碎，用75%乙醇热回流提取（25LX3次），合并提取液， 浓缩至无醇味得到浓缩液（6L);对浓缩液依次用石油醚（6LX3次）、乙酸乙酯（6LX3次） 和水饱和的正丁醇（6LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物305g，正丁醇萃取物用5L蒸馏水溶解后用AB-8大孔树脂（2kg，柱体积1. 5L)富集，先 用10%乙醇冲洗8个柱体积（12L)除去多糖，再用65%乙醇洗脱10个柱体积（15L)，收集 65%洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥得杜仲叶提取物浸膏粉185g。
[0027] 实施例2 :液相色谱分析
[0028] 供试品溶液配制：取实施例1方法制得的提取物浸膏粉5mg至50mL棕色容量瓶 中，加30mL20%乙腈水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加20%乙腈水溶液定容。
[0029] 分析方法：
[0030]液相色谱仪：Agilent1260,二元栗；色谱柱：DiamonsilC18 柱（4. 6mmX250mm， 5ym)；
[0031] 流动相：A为乙腈，B为0. 1%磷酸溶液（三乙胺调节pH值至6. 2);
[0032]梯度洗脱程序：0?01 ~70min，A20% - 80% ;
[0033] 流动相流速：1.OmL?minS检测波长：240nm;柱温：30°C;进样量：10yL。
[0034] 对用10批不同产地、批次杜仲叶制备的提取物进行分析，建立指纹图谱进行匹 配，结果1~9号峰在10批样品色谱图中均出现。因此标定9个峰为共有指纹峰，据此建 立该提取物的HPLC指纹图谱，结果见图1。
[0035] 实施例3:杜仲叶提取物药理试验
[0036] 一、试验方法
[0037] 1、细胞分组
[0038] 将细胞分为6组，每组6个复孔：（1)正常培养组（N组）：完全培养基，正常条件下 培养；(2)缺血再灌注组（IR组）：完全培养基正常条件下培养lh后，模拟缺氧8h，再灌注 4h; (3)杜仲叶提取物组：RE1组：杜仲叶提取物0. 5ng/mL预处理lh;RE2组：杜仲叶提取物 5ng/mL预处理lh;RE3组：杜仲叶提取物50ng/mL预处理lh;模拟缺氧8h，再灌注4h; (4) 生理盐水组（NS组）：以与杜仲叶提取物同等体积的生理盐水预处理lh，模拟缺氧8h，再灌 注4h。
[0039] 2、杜仲叶提取物的预处理
[0040] (1)杜仲叶提取物的配制：将lmg杜仲叶提取物溶解于500mL生理盐水中。移液枪 吸取2. 5mL于第一支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为500ng/mL的杜仲叶 提取物溶液。从第一支离心管中吸取lmL至第二支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制 成浓度为50ng/mL的杜仲叶提取物溶液。从第二支离心管中吸取lmL至第三支离心管中， 用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为5ng/mL的杜仲叶提取物溶液。作好标记。
[0041] (2)杜仲叶提取物预处理：正常培养组和缺血再灌注组以每孔100yL新鲜的完 全培养基更换。RE1组每孔加入5ng/mL的杜仲叶提取物溶液10yL和新鲜的完全培养基 90yL，RE2组每孔加入50ng/mL的杜仲叶提取物溶液10yL和新鲜的完全培养基90yL， RE3组每孔加入500ng/mL的杜仲叶提取物溶液10yL和新鲜的完全培养基90yL。生理盐 水组每孔加入生理盐水10yL和新鲜的完全培养基90yL。轻轻摇动96孔板，使药液充分 混混匀，放入C02培养箱中孵育lh。
[0042] 3、肝细胞体外模拟缺血再灌注损伤模型的建立：
[0043] (1)体外模拟缺血过程：预处理时间结束后，从细胞培养箱中取出第一块96孔板， 正常培养组每孔用100yL完全培养基更换，放入C02培养箱中继续培养8h。从C02培养箱 中取出第二块96孔板，缺血再灌注组、杜仲叶提取物预处理组和生理盐水组每孔用100yL 无糖DMEM培养基置换完全培养基，放入缺氧培养盒中，培养盒中放入盛有50mL灭菌水的 无菌小瓶保持饱和湿度。将缺氧培养盒放入37°C恒温孵育箱中，进气口连接94%N2-5 %C02-1 % (V混合气体，出气口连接氧气检测仪。以2L/min的气体流量通入混合气体，当氧 气检测仪显示出气口氧气浓度〈1 %时，调节混合气体流量300mL/min维持出气口氧气浓度 〈1%。以此模拟缺血过程8h。
[0044] (2)体外模拟再灌注过程：从C02培养箱中取出第