增强干细胞治疗潜能的组合物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞组合物和方法。
[0002] 发明背景
[0003] 干细胞疗法是骨髓、皮肤、心脏、角膜移植、移植物抗宿主病、肝肾衰竭、肺损伤、类 风湿性关节炎、自身免疫病例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、狼疮和糖尿病治 疗；心血管医药、神经性疾病和同种异体移植物排斥预防中的理想方法。
[0004] 可从不同组织，例如骨髓、骨骼肌、牙髓、骨骼、脐带和脂肪组织分离间充质干细胞 (MSC)和/或祖细胞或前体细胞。作为再生药物中治疗方法的可能来源，MSC正引起越来越 高的兴趣。干细胞能自我更新并能分化成特定细胞类型，或能治疗性地用于促进组织再生 的可溶性因子的产生和分泌。具体说，大量自体移植来源的成年干/祖细胞比起胚胎干细 胞（ES)类型来说，在其大量可获得性、低肿瘤生成性和能避免与ES细胞有关的伦理争议上 都更有优势。
[0005] 为了实现有效修复或再生缺陷或患病器官和组织的能力，供体干/祖细胞应当具 有理想的治疗性能，例如最小化的副作用，能整合入宿主组织，分化成所需的细胞系，旁分 泌效果，调节组织重建和激活内源性修复/再生机制。
[0006] MSC已被用于许多啮齿动物、家兔、狒狒等的临床前研究，针对骨髓、皮肤、心脏和 角膜移植、移植物抗宿主病、肝肾衰竭、肺损伤、多发性硬化、类风湿性关节炎、糖尿病和狼 疮疾病。这些研究的一些早期结果已经引发了现在正进行中的人类临床试验。这些试验涉 及治疗自身免疫病，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化和1型糖尿病；同种异体移 植排斥的预防；和增强骨髓和肾移植的存活率；以及顽固性移植物抗宿主病的治疗。
[0007] 心血管疾病的患病和引起死亡的主要因素是冠状和/或外周血管系统中运输血 液的血管部分或完全堵塞的后果。当这些血管部分堵塞时，血液流动不足导致这些血管供 应的肌肉组织缺血，从而抑制肌肉收缩和/或其功能。血液流动完全堵塞导致肌肉组织坏 死。
[0008] 外周动脉病（PAD)影响了八百万美国人。它是腿部动脉变窄的结果。PAD的最常 见症状是走路时疲劳、抽筋或疼痛。然而，一些PAD患者会丧失行走能力并不得不截肢。
[0009] 在一些患者个体中，血管阻塞部分由天然过程补偿，其中形成新血管（通常称作 "血管生成"的过程）以及小血管扩大（称为"动脉发生"）来代替受损血管的功能。这些 新血管能促使耗竭组织的血流恢复，从而形成围绕堵塞血管的"天然旁路"。
[0010] 然而，一些血管生成受损的患者不能产生足够的旁系血管，以充分补偿心血管疾 病导致的血流减少。需要治疗缺血疾病的新治疗方法。
[0011] 各种研究已经评估了 MSC在临床前动物模型中的疗效，且显示了极大的临床潜 能。然而，仍然存在对于最佳MSC剂量，给药途径，和灌注后MSC细胞命运的主要问题。
[0012] 同样，非常需要优化的治疗性MSC组合物以及使用这些组合物的方法，以缓解各 种疾病症状，特别是血管疾病治疗。
[0013] Walker等，Nat Commun?作者手记，2010年可得）一般公开了用非肌肉肌球蛋 白II (匪II)拮抗剂布雷他汀处理人多潜能干细胞（hPS)，例如人胚胎干细胞（hES)和经 诱导的多潜能干细胞（hiPS)能增强hPS细胞在克隆密度和悬浮条件下的存活。美国公开 号20100216181公开了用布雷他汀作为存活因子在无血清和饲养细胞的培养基中培养多 潜能干细胞。通过在旋转瓶或生物反应器内培养细胞来增加细胞数量。公开的PCT申请 W02012062819公开了一种控制细胞与基材结合的方法，该方法使用布雷他汀作为细胞与其 通常没有亲和力或亲和力有限的基材的细胞黏着的促进剂。
[0014] 然而，这些文献都没有教导或提示当用含干细胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗剂治 疗患者时观察到出乎意料的较好结果。
【发明内容】
[0015] 本发明的一个方面涉及一种治疗血管疾病的方法，包括向有需要的患者给予有效 量的含有一群细胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗剂的组合物，从而治疗该血管疾病。
[0016] 在一个实施方式中，血管疾病是糖尿病的结果。在另一个实施方式中，血管疾病是 动脉粥样硬化的结果。在另一个实施方式中，血管疾病是外周血管疾病（PVD)。在还有一个 实施方式中，血管疾病是外周动脉疾病（PAD)。在还有一个实施方式中，血管疾病与约或小 于〇. 9的踝肱压力指数相关。在还有一个实施方式中，血管疾病与约或小于0. 7的踝肱压 力指数相关。在还有另一个实施方式中，血管疾病导致重症肢体缺血。在另一个实施方式 中，血管疾病导致皮肤溃疡或坏疽。在另一个实施方式中，组合物导致或增强血管生成。在 还有另一个实施方式中，组合物导致或增强血管生成，其与对照相比增加至少约20%。
[0017] 在还有一个实施方式中，一群细胞的一部分包含多潜能细胞（pluripotent cell)。在还有另一个实施方式中，多潜能细胞是经诱导的多潜能干细胞。在还有一个实施 方式中，一群细胞的一部分包含多能细胞（multipotent cell)。在还有另一个实施方式中， 多能细胞是多能间充质细胞或间充质干细胞。在还有另一个实施方式中，多能细胞衍生自 经诱导的多潜能干细胞。在还有其他实施方式中，该组合物包含药学上可接受的运载体。
[0018] 在另一个实施方式中，与同一未接受该组合物的患者相比，患者的肢体功能增强 了约或至少2-3级。在另一个实施方式中，患者的肢体血流提高到正常或未治疗的肢体血 流的约或至少65-85%。在另一个实施方式中，与同一未接受该组合物的患者相比，患者的 缺血损伤改善了约或至少2、3、或4级。在另一个实施方式中，与同一未接受该组合物的患 者相比，患者的缺血损伤以更快的速度（或以加速）改善。
[0019] 在还有一个实施方式中，静脉内给予组合物。在还有一个实施方式中，肌肉内给予 组合物。在另一个实施方式中，肌肉内或在缺血损伤位点附近给予组合物。在还有另一个实 施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂敲减非肌肉肌球蛋白II基因和/或蛋白质表达。在 还有另一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是靶向敲减非肌肉肌球蛋白II基因和/ 或蛋白质表达的SiRNA。在另一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是靶向敲减非肌 肉肌球蛋白II基因和/或蛋白质表达的编码siRNA、miRNA或反义RNA的DNA载体。在其 他实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是血管紧张素II受体拮抗剂或血管紧张素受体 阻滞剂。在另一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是血管紧张素转化酶（ACE)抑制 剂。在另一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是2, 3-丁二酮-2--肟（BDM)。在还 有一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是布雷他汀或其类似物、衍生物或变体。在 还有一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是吡咯烷酮衍生物。在还有一个实施方式 中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是吡咯烷酮家族的分子。
[0020] 本发明的还有一个方面涉及一种试剂盒，其包含：一群多能细胞；非肌肉肌球蛋 白II拮抗剂；药学上可接受的运载体；和可任选的，将这些物质给予适合用干细胞疗法治 疗的患者的说明书。在一个实施方式中，该疾病是心血管疾病。在另一个实施方式中，该疾 病是外周动脉疾病。
[0021] 在一个实施方式中，细胞是MSC。在另一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂 是布雷他汀。在另一个实施方式中，心血管疾病是外周动脉疾病。在另一个实施方式中，细 胞是MSC，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是布雷他汀，且心血管疾病是外周动脉疾病。在另一个 实施方式中，试剂盒还包含心血管药。在另一个实施方式中，试剂盒还含有支架。在另一个 实施方式中，试剂盒还包含药物洗脱性支架。在一个实施方式中，组成试剂盒的部件置于分 隔的容器中。在另一个实施方式中，一群多能细胞；非肌肉肌球蛋白II拮抗剂；和药学上 可接受的运载体在同一容器中，例如注射器或自动给药装置中。试剂盒可用于外周动脉疾 病。试剂盒可含有MSC细胞。非肌肉肌球蛋白II拮抗剂理想为布雷他汀，疾病为外周动脉 疾病。试剂盒还可包含心血管药，和/或支架，和/或药物洗脱性支架。各部件可在分隔的 容器中、同一容器中或在注射器中。
[0022] 本发明的另一个方面涉及一种降低用包含MSC的组合物治疗的外周动脉病患者 中截肢率的方法，包括在治疗前使MSC接触非肌肉肌球蛋白II拮抗剂。在一个实施方式 中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是布雷他汀。在另一个实施方式中，截肢率降低了至少约 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，或 90%或以上。
[0023] 本发明的另一个方面涉及一种用于治疗适合用干细胞疗法治疗的疾病的干细胞 组合物，该组合物包含一群多能细胞；和非肌肉肌球蛋白II拮抗剂。在本发明该方面的一 个实施方式中，细胞是MSC。在另一个实施方式中，非肌肉肌球蛋白II拮抗剂是布雷他汀。
[0024] 本发明的另一个方面涉及一种制备用于治疗适合用干细胞疗法治疗的疾病的干 细胞组合物的方法，所述干细胞组合物包含一群多能细胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗剂，其 中将一群多能细胞和NM II拮抗剂一起孵育一段时间，然后给予患者。
[0025] 本发明的另一个方面涉及一种使适用干细胞疗法治疗的疾病加速治愈的方法，包 括使用含有一群多能细胞和非肌肉肌球蛋白II拮抗剂的组合物治疗患者，其中该组合物 与不含非肌肉肌球蛋白II拮抗剂的组合物相比导致疾病更快治愈。
[0026] 在这些方面的一些实施方式中，细胞是MSC。在其他实施方式中，匪II拮抗剂是 布雷他汀。在还有其他实施方式中，疾病是心血管疾病。
【附图说明】
[0027] 当考虑附图及相应详细描述时，可以更完整地理解本发明。附图所示实施方式仅 仅是举例说明发明，不应考虑为将发明限制于所示实施方式。
[0028] 图IA-B显示了随时间血流:对于所有有效动物计算各组中值。布雷他汀 (BB)加速和增强间充质干细胞移植引发的血流再生。与预先用布雷他汀处理但在不存在布 雷他汀的情况下移植的干细胞（1A，第5组，实心黑方块）相比，在布雷他汀存在下给予的 干细胞（1A，第4组，菱形）显示更快且增强的动物中血流再生。含有布雷他汀的培养基对 照（1A，第2组，圆形）显示少量的恢复效果，与MSC-样，后者在稍后的时间点才获得了恢 复（1A，第3组，三角形）。MSC的肌肉内给药显示与静脉内施用相比持续较好的效果。数 据显示单独的布雷他汀（BB)对血流再生没有效果，但在与干细胞同时施用时，布雷他汀增 强和/或支持MSC的再生潜能。
[0029] 图2A-B显示了随时间的肢体功能:对于所有有效动物计算各组中值。数据 显示与MSC共存的布雷他汀（BB)支持肢体功能的迅速改善。尽管在其他治疗组中有血液 灌注改善，治疗28天后观察到肢体功能恶化和肢体坏死有所增加。第3组显示了动物间较 广泛的分布和较高的截肢发生率。数据显示静脉内治疗（2B)某种程度上效果较差，与局部 肌肉内治疗方案相比导致更多的并发症（图2A)。在布雷他汀存在下接受移植的MSC的小 鼠（2A，第4组，空心方块）在移植后显示随时间稳定和迅速的肢体功能改善。在用较低量 的布雷他汀预处理的MSC治疗的小鼠中检测到了相同趋势（2A，第5组，三角形）。相反，单 独施用MSC直到第20天才显示轻微改善，而且肢体功能在后来的时间点变差。培养基对照 仅显示少量效果。注意，负斜率表示肢体功能的改善。再一次，MSC的肌肉内给药（2A)持续 显示优于静脉内施用（2B)的效果。在布雷他汀存在下施用MSC