基于dc的hcv病毒表位疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及利用脐带间充质干细胞诱导转化 为胰岛细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒（HCV)是引起慢性肝病的主要病原体之一，全世界约有HCV感染者 1. 7亿-2. 0亿，我国人群HCV感染率约3. 2 %，估计全国感染者在4000万以上。HCV感染后， 约50 % -85 %转为慢性肝炎，其中20 % -30 %发展为肝硬化，部分转为肝细胞肝癌（HCC)，严 重危害人类健康，已成为全球性的、严峻的公共卫生问题。迄今为止，尚缺乏理想的抗病毒 治疗措施，干扰素治疗也不令人满意。由于HCV病毒变异率高，以保护性抗体为主的预防性 HCV疫苗的研究步履维艰。因此，寻求抗HCV疫苗和有效抗病毒药物一直是研究的热点。
[0003] 现有技术中，HCV病毒疫苗的制备方法为：对HCVNS3区和HCVNS5区抗原蛋白的氨 基酸序列进行了分析，俩个多肽链的链的氨基酸序列分别为：HCVNS3:pvsylkgssg(10个氨 基酸残基）HCVNS5: nmvyattsrs (10个氨基酸残基），多肽纯度为95 % -99. 99 %，采用Fmoc 固相法结合成线性多肽疫苗，经脱盐及HPLC纯化后得到抗原肽，溶于医学蒸馏水制成疫苗 溶液。通过该方法制备的HCV病毒疫苗由于是多肽溶于水溶液制备而成的，因此，性状不够 稳定，免疫原性较弱，特异性不强，不能很好引起机体的免疫反应，杀伤HCV病毒；另外，由 于缺乏一些免疫辅助因子的表达，不能够很好的调节HCV病毒的机体免疫机制，不能改善 HCV病毒引起的肝脏免疫耐受的现象。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中HCV病毒疫苗性状不稳定、免疫 原性较弱、特异性不强等缺陷，提供一种性状稳定，免疫原性及特异性强的基于DC的HCV病 毒表位疫苗。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种基于DC的HCV病毒表位疫 苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0006] 获取未成熟DC ;
[0007] 加入HCV病毒抗原多肽与未成熟DC共培养；
[0008] 再加入肿瘤坏死因子-a和白介素或脂多糖继续培养，至DC成熟且负载上HCV病 毒抗原多肽。
[0009] 在本发明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制备方法中，所述白介素为白介 素-1。
[0010] 在本发明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死因 子-a的浓度为l-10ng/ml、白介素-1的浓度为5-15ng/ml、脂多糖的浓度为l-10ng/ml。 [0011] 在本发明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死因 子-a的浓度为浓度为5ng/ml、白介素-1的浓度为8ng/ml。
[0012] 在本发明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死因 子-a的浓度为浓度为lOng/ml、白介素-1的浓度为5ng/ml。
[0013] 在本发明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制备方法中，所述肿瘤坏死因 子- a的浓度为浓度为lng/ml、白介素-1的浓度为15ng/ml。
[0014] 在本发明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制备方法中，加入肿瘤坏死因 子-a和白介素或脂多糖后继续培养未成熟DC和HCV病毒抗原多肽7-13天。
[0015] 在本发明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制备方法中，所述HCV病毒抗原多 肽由多肽链HCVNS3和HCVNS5合成。
[0016] 在本发明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制备方法中，所述HCV病毒抗原多 肽与未成熟DC在含有粒-巨噬细胞因子和白介素-4的培养基上进行共培养。
[0017] 在本发明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制备方法中，加入肿瘤坏死因 子-a和白介素或脂多糖后继续培养未成熟DC和HCV病毒抗原多肽7-13天。
[0018] 本发明还提供一种基于DC的HCV病毒表位疫苗，由上述基于DC的HCV病毒表位 疫苗制备方法所获得。
[0019] 实施本发明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗及其制备方法，可以达到以下有益 效果：通过本发明获得的基于DC的HCV病毒表位疫苗不仅性状较稳定，而且免疫原性及特 异性较强，能够很好的调节HCV病毒的机体免疫机制，改善HCV病毒引起的肝脏免疫耐受的 现象。
【附图说明】
[0020] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0021] 图1为采用ELISA法检测经疫苗刺激小鼠后小鼠机体血清中的白细胞介 素-12(IL-12)水平；
[0022] 图2中从左至右分别为本发明实验四中，肿瘤初始示意图以及接种现有HCV病毒 疫苗后，每间隔2d所得到的肿瘤示意图；
[0023] 图3中从左至右分别为本发明实验四中，肿瘤初始示意图以及接种实施例1提供 的基于DC的HCV病毒表位疫苗后，每间隔2d所得到的肿瘤示意图。
【具体实施方式】
[0024] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0025] 本发明提供的一种基于DC的HCV病毒表位疫苗，其制备方法包括以下步骤：
[0026] 1)将CD34+和/或CD14 +单核细胞诱导培养为未成熟DC ;
[0027] 2)待未成熟DC浓度小于或等于5 X IO5个/ml时，加入HCV病毒抗原多肽与未成 熟DC共培养；
[0028] 3)再加入肿瘤坏死因子-a和白介素或脂多糖继续培养7-13天，至DC成熟且DC 负载上HCV病毒抗原多肽。
[0029] 在步骤1)中，本发明提供的将CD34+和/或CD14 +单核细胞诱导培养为未成熟DC 的方法为：将CD34+和/或CD14 +单核细胞接种到含粒-巨噬细胞和白介素-4的培养基中 并在37°C，CO2浓度为5%的条件下诱导6-9天后，即可获得未成熟DC，未成熟DC的表型和 功能均不完善，不能诱导有效的免疫反应。当然可以理解的是，本发明获得未成熟DC的途 径也并不局限于此，通过现有技术中的诱导方法诱导单核细胞获得的未成熟DC同样适用 于本发明。
[0030] 其中，⑶34+单核细胞可以从骨髓、脐带血或脾脏等分离得到；⑶14 +细胞从人外 周血分离得到的。由于从脐带血中纯化出CD34+单核细胞费用昂贵；骨髓采集不易，而且 容易污染，患者比较痛苦，扩增费用昂贵；而脾脏来源受限等使得CD34+单核细胞获取较困 难；因此，在本发明中，优选采用从人外周新鲜血液中分离筛选出CD14 +单核细胞，从新鲜 血液中获取，相比经过冷库储存或者培养传代之后的CD14+单核细胞，从新鲜血液中提取的 CD14 +单核细胞离体时间不长，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利 于获取DC。
[0031]由于DC有簇状生长的习惯，浓度太高，集结成团，位于中心的DC不易成熟，影响 HCV病毒抗原的负载，从而影响疫苗的免疫效果，因此，DC浓度不易过高，在该步骤中，未成 熟DC在培养基中的浓度小于或等于5 X IO5个/ml ;
[0032] 步骤2)中，HCV病毒抗原多肽由多肽链HCVNS3和HCVNS5通过Fmoc固相法结合而 成，具体合成步骤为现有技术，在此不再赘述。由于多肽纯度与DC负载的抗原量成正比，因 此，多肽纯度越高，DC负载的抗原量越高，在本发明中，优选地，多肽纯度为95% -99. 99%; 多肽链的氨基酸序列为HCVNS3 :pvsylkgssg(10个氨基酸残基）和HCVNS5 :nmvyattsrs(10 个氨基酸残基）。
[0033] 由于未成熟DC表达能介导DC摄取抗原的一些膜受体如Fc受体等，因而相比成 熟DC拥有更强的抗原摄取、加工和处理能力，因此，步骤2)中利用未成熟DC与HCV病毒抗 原多肽共培养实现HCV病毒抗原多肽的预负载，促进提高HCV病毒抗原多肽负载量，同时， 未成熟DC经抗原致敏可至成熟。
[0034] 在步骤3)中，由于白介素和脂多糖功能均具有促进DC细胞成熟的功能，因此在该 步骤中采用其中一种即可。由于DC细胞成熟后会分泌白介素-1，因此，在该步骤中，优先 采用白介素-1来促进DC细胞的成熟，起到反馈诱导的作用。白介素-1由活化的巨噬细胞 所产生，机体免疫细胞受抗原刺激后产生；而肿瘤坏死因子-a由体内免疫细胞（如T淋 巴细胞、T细胞杂交瘤、T淋巴样细胞系以NK细胞等）分泌的一种单核因子，由于白介素-1 和肿瘤坏死因子-a由不同细胞产生，因此，同时添加白介素-1和肿瘤坏死因子-a对未 成熟DC的刺激作用较强，能够促进DC成熟的同时提高HCV病毒抗原多肽的负载率，并且能 够稳定DC的抗原提呈性；优选地，肿瘤坏死因子-a的浓度为l-l〇ng/ml、白介素的浓度为 5-15ng/ml、脂多糖的浓度为l-10ng/ml。
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