一种鹿茸多肽混合物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽类生物药物领域，具体地说，涉及一种鹿茸多肽混合物及其制备 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 炎症是当病原体侵袭机体时，机体发生的一种重要的防御反应。过量的炎症反应 会导致发生一些慢性炎症疾病，如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、哮喘、鼻炎、咽炎和肠道 炎性疾病等。目前治疗或干预慢性炎症疾病的方法，包括留体类和非留体类抗炎药。然而， 这些药物疗效有限，且存在较多严重的并发症和副作用，如胃肠道不适、肾毒性、增加心脏 病发作的危险率等。因此，开发具有炎症防治功效的食品功能因子，对防治炎症、提尚食品 的附加值、开发相关功能性食品和保健品均具有重要意义。
[0003] 蛋白质经胃肠消化、发酵或体外水解，在蛋白酶的作用下可产生一些具有特殊生 理调节作用的生物活性肽。同时，寡肽的吸收具有快速、不易饱和、耗能低、与氨基酸的吸收 无竞争等特点。近年来，抗炎肽引起了科研人员的关注。已有报道发现一些从蛋白质的水 解物中分离的多肽具有抗炎作用，如三文鱼多肽、大豆多肽、菜豆多肽、螺旋藻多肽和贝类 多肽等，可以有效减少促炎细胞因子和增加抗炎因子的表达。
[0004] 鹿茸是我国传统名贵中药，可用于功能性食品和保健品，具有生精补髓、养血益 阳、强筋健骨、延年益寿等功效。蛋白质是鹿茸中最主要的化学成分，占干重的52%以上。 鹿茸多肽具有免疫调节、抗炎、促进细胞增殖及修复神经损伤等生物学效应，作为鹿茸的功 能成分之一已经得到认可。然而，现有对于鹿茸的研究多集中于脂溶性成分及天然存在的 生物活性肽，而常常忽视对高含量的蛋白质的开发和利用，且鲜有对鹿茸蛋白水解物功能 活性的报道。因此，高效利用鹿茸蛋白资源，制备源自鹿茸蛋白的抗炎多肽，开发相关的功 能性食品和保健品具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种鹿茸多肽混合物及其 制备方法与应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种鹿茸多肽混合物，所述鹿茸多肽混 合物的主要组分为 Ala-His-Gly，Ala-His-Trp-Lys，Val-His，Leu-Ala-Gln，Ile-Ala， Ala-Tyr，Ala-Leu 和 Thr-Leu0
[0007] 进一步地，所述多肽混合物的制备方法包括如下步骤：
[0008] 1)将鹿茸蛋白先后使用胃蛋白酶和胰酶进行水解，灭酶后得到鹿茸蛋白水解物；
[0009] 2)从鹿茸蛋白水解物中分离分子量小于3kDa的多肽组分；
[0010] 3)经分离纯化得到鹿茸多肽混合物。
[0011] 进一步地，所述胃蛋白酶的添加量为鹿茸蛋白质量的1/500,所述胰酶的添加量为 鹿茸蛋白质量的1/250。
[0012] 进一步地，所述步骤3)具体为：
[0013] a.将分子量小于3kDa的多肽组分进行浓缩使用大孔吸附树脂进行分离纯化，采 用乙醇梯度洗脱，测定各220nm吸收峰对应的洗脱液的抗炎活性，收集抗炎活性最高的组 分；
[0014] b.将上述组分用凝胶过滤色谱柱进行分离，采用去离子水洗脱，测定各220nm吸 收峰对应的洗脱液的抗炎活性，收集抗炎活性最高的组分；
[0015] c.将上述组分用半制备型反相HPLC进行分离，采用含0. 1%三氟乙酸的乙腈溶 液梯度洗脱，测定各220nm吸收峰对应的洗脱液的抗炎活性，收集抗炎活性最高的组分，SP 得。
[0016] 针对步骤3)，本发明提供一个【具体实施方式】如下：
[0017] a.将分子量小于3kDa的多肽组分进行浓缩，使用大孔吸附树脂 DA201-C(2. 6X40cm)进行分离纯化，上样量为10mL，样品浓度为30mg/mL，采用乙醇梯度洗 脱，洗脱流速为3mL/min。首先用去离子水洗脱2个柱体积，然后用乙醇梯度（0~100%乙 醇）洗脱3个柱体积，最后再用无水乙醇洗脱2个柱体积。混合物中的多肽按疏水性被流动 相依次洗脱下来，用紫外检测器监测洗脱液在220nm吸收峰，收集洗脱体积在600~1150mL 的组分，冻干成粉末；
[0018] b.将上述组分用凝胶过滤色谱柱SephadexG_15(l. 6 X 70cm)进行分离，上样量 为5mL，样品浓度为5mg/mL，采用去离子水洗脱，洗脱流速为I. 5mL/min，洗脱4个柱体积，混 合物中的多肽按分子量大小依次被洗脱下来，用紫外检测器监测洗脱液在220nm吸收峰， 收集洗脱体积在60~120mL的组分，冻干成粉末；
[0019] c.将上述组分用半制备型反相HPLC分离，分离时使用ODS色谱柱（Eclipse XDB-C187 ym，21. 2 X 250mm)，采用含0. 1 %三氟乙酸（TFA)的乙腈溶液梯度洗脱，上样量为 3mL，样品浓度为10mg/mL，流动相A为含0. 1 % TFA的乙腈，流动相B为含0. 1 % TFA的超 纯水；洗脱条件为：〇 ~IOmin 1% A ;10 ~60min 1 ~45% A ;60 ~70min 45 ~100% A ; 70~85min 100%A;85~90min 100~0%A;洗脱流速为5mL/min，用紫外检测器监测洗 脱液在220nm吸收峰，收集洗脱时间在22~26min的组分，冻干成粉末，即得所述多肽混合 物。
[0020] 进一步地，所述抗炎活性的测定方法如下：
[0021] 1、收集组分，冻干成粉末，配制成质量百分比浓度为0.05%的样品溶液测定其抗 炎作用。
[0022] 2、制备3 X IO5个/mL的RAW264. 7巨噬细胞悬液，按100 y L/孔加入到96孔培养 板中，置于37°C、5% 0)2的培养箱中培养3小时。之后吸弃上清，按IOOyL/孔加DMEM完 全培养基和10 y L LPS溶液（终浓度为10 y g/mL)，样品组添加10 y L不同的样品溶液，空 白以PBS代替样品，然后将培养板置于37°C、5% 0)2的培养箱中培养24小时。采用经典的 Griess法检测培养液中NO含量，通过NO2与磺酸及萘乙烯二胺盐酸盐反应生成粉红色偶 氮化合物，于波长550nm比色，间接测得NO含量。NO含量越低，表明样品的抗炎作用越强。
[0023] 按照上述分离，使用液相色谱偶联串联质谱技术鉴定所述鹿茸多肽混合物中多肽 的氨基酸序列，共得到了八个多肽序列，如表1所示。
[0024] 表1本发明所述鹿茸多肽混合物中的八个多肽序列
[0026] 进一步地，所述步骤1)具体为：将鹿茸蛋白与水混合，得到混合液，在37±l°C，pH =1.5~2.0的条件下，利用胃蛋白酶水解2~4小时，再在37±1°C，pH = 5.0~8.0的 条件下，利用胰酶水解4~8小时。
[0027] 其中，所述混合液中鹿茸蛋白的质量百分比为2%~5%。
[0028] 进一步地，所述步骤2)具体为：将鹿茸蛋白水解物进行离心分离，收集上清液，并 将获得的上清液采用3kDa超滤膜进行分离，收集下层清液，得到分子量小于3kDa的多肽组 分。
[0029] 本发明还提供了前述鹿茸多肽混合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0030] 1)将鹿茸蛋白先后使用胃蛋白酶和胰酶进行水解，灭酶后得到鹿茸蛋白水解物；
[0031] 2)从鹿茸蛋白水解物中分离分子量小于3kDa的多肽组分；
[0032] 3)经分离纯化得到鹿茸多肽混合物。
[0033] 其中，所述的灭酶处理为采用加热的方法使蛋白酶失活，例如，沸水浴加热10分 钟。
[0034] 进一步地，所述鹿茸蛋白为从鹿茸及其副产物中提取得到的蛋白。
[0035] 具体为：取新鲜鹿茸或鹿茸副产物经冷冻干燥后低温粉碎制成粉末。称取100g粉 末加入800mL蛋白提取液（lOOmmol/L Tris+6mol/L盐酸胍+0.02mol/L EDTA-2Na+l%蛋白 酶抑制剂），4°C浸提36h，然后于4500rpm离心30分钟，收集上清液。经梯度盐析、透析、冷 冻干燥得鹿茸水溶性蛋白，低温密封保存。
[0036] 本发明还提供了含有前述鹿茸多肽混合物的功能性食品或保健品或药物。
[0037] 本发明还提供了前述鹿茸多肽混合物在制备具有抗炎活性的功能性食品或保健 品或药物中的应用。
[0038] 本发明的有益效果在于：
[0039] 本发明提供的具备抗炎活性的鹿茸多肽混合物，原料成本低，鹿茸蛋白可来源于 炸茸水、鹿茸胶、鹿茸皮、鹿茸渣等鹿茸精加工中的副产物，鹿茸精残渣常用作畜禽饲料添 加剂，从而使成品具有较高的附加值。
[0040] 本发明提供的鹿茸多肽混合物，能够显著抑制炎症巨噬细胞NO的生成，具有很强 的抗炎作用，在对由慢性炎症诱发的疾病的防治和辅助治疗方面具有较好的应用前景。该 产品可用于功能性食品、保健品、动物食品及饲料等，应用范围广，具有很高的社会和经济 效益。
[0041] 本发明提供的鹿茸多肽混合物，从蛋白酶解液中获取，安全性高，生产条件温和， 生产条件易于控制及成本低，易于开发利用。
[0042] 本发明提供的鹿茸多肽混合物，主要由2~4个氨基酸的多肽组成，分子量小，更 易被消化道吸收和直接利用。
【附图说明】
[0043] 图1为本发明所述的鹿茸蛋白水解液小于3kDa超滤组分经大孔吸附树脂DA201-C 分离的洗脱曲线（A)及各分离组分的抗炎作用（B)。
[0044] 图2为图1中组分F2经S^hadex G-15凝胶过滤层析分离的谱图（A)及各分离 组分的抗炎作用（B)。
[0045] 图3为图2中组分G2经半制备反相高效液相分离（RP-HPLC)的谱图（A)及各分 离组分的抗炎作用（B)，组分H3的抗炎作用最强。
[0046] 图4为图3中组分H3所含八种主要多肽的串联质谱图。
【具体实施方式】
[0047] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0048]实施例1酶法制备含抗炎肽的鹿茸蛋白水解物
[0049] -、鹿茸水溶性蛋白的制备
[0050] 取新鲜鹿茸或鹿茸副产物经冷冻干燥后低温粉碎制成粉末。称取100g粉末加入 800mL 蛋白提取液（100mmol/L Tris+6mol/L盐酸胍+0. 02mol/L EDTA-2Na+l%蛋白酶抑制 剂），4°C浸提3