多重靶向抗肿瘤复合制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种多重靶向抗肿瘤复合制剂及其制备 方法，该复合制剂能启动自身免疫，提高抗肿瘤效果。
【背景技术】
[0002] 目前治疗肿瘤的方法主要有手术治疗、放射治疗、化学治疗以及生物治疗等，因其 各有优缺点，而在肿瘤治疗中各有其地位和作用。化学治疗，利用化学药物的细胞毒性来杀 死肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长。但小分子化疗药物往往缺乏可识别肿瘤细胞的特定基 团而导致其在非肿瘤组织的大量分布，提高给药剂量在增加疗效时往往得不偿失地给机体 带来更强烈的毒副作用。临床上通常给予次优剂量以降低严重的副作用，但此种做法往往 会影响肿瘤组织药物浓度从而降低治疗效果。
[0003] 为克服这些缺陷，逐步发展出如脂质体递送、聚合物微粒包载以及聚合物/抗 体-药物结合物等多种方法。这些方法通过改善化疗药物的溶解度或延长血液循环时间来 降低化疗的毒副作用，最终通过EPR效应增加药物在肿瘤部位的蓄积。除了能改善传统化 疗药物的抗肿瘤效果和毒性之外，药物包载后往往还能够在某种程度上克服临床普遍存在 的多药耐药问题。但是，病变细胞复杂的内环境迫切需要发展一种替代疗法来取代或补充 现存的抗肿瘤药物递送策略。靶向给药系统具有使药物靶向到肿瘤组织定点释放的优势， 逐渐成为国内外肿瘤研究的一大热点。特别是在纳米给药系统应用到肿瘤化疗以后，越来 越多的纳米系统显示出良好的抗癌活性和较低的细胞或组织毒副作用。临床常见的另一种 方法是联合给药，不同作用机理的化疗药物联合使用，不仅可以降低单药给药剂量从而减 少毒副作用，而且还能改善药物体内分布，增加药物对靶标的作用效应，从而延长患者的生 存期。
[0004] 尽管如此，在大多数情况下，单一的化学治疗仍仅能延长患者的生存期而难以达 到治愈的目的，即使肿瘤消失其复发的可能性仍旧极大。且近期研究还发现，药物治疗可造 成肿瘤的适应性进化，该发现发表在今年3月的Nature杂志上。
[0005] 免疫治疗主要是给予机体免疫相关物质以激发或调动免疫系统，增强内环境中对 肿瘤细胞的识别能力，从而杀伤肿瘤细胞。上世纪50年代，随着免疫逃逸学说的发现使免 疫治疗逐渐兴起。与化疗药物的细胞毒作用不同，免疫系统自身在不损伤正常组织的前提 下能够特异性识别并杀灭肿瘤，而且可以产生长久记忆来防止肿瘤复发，因此疗效持久且 温和甚至有望根治肿瘤。Nature杂志甚至发文认为，未来10年60%的肿瘤患者将主要接受 免疫治疗。
[0006] 然而，肿瘤并非局部发生的静态疾病，不同个体、不同组织的肿瘤抗原性并不相 同，相互之间可能亦无交叉反应；其次，个体的免疫功能千差万别；还存在其他因素，导致 肿瘤免疫反应各异，让肿瘤的免疫治疗举步维艰，此外，缺乏预测指标、有效性不可预测且 仅限于少数患者等问题也逐见端倪，成为研发抗癌免疫治疗的瓶颈。
[0007] 免疫治疗虽有对机体温和甚至可防止肿瘤复发等优势，但周期相对较长且只能清 除少量残留肿瘤细胞而对发展后期的实体瘤效果不理想，若不在肿瘤发展初期对其进行遏 制，在肿瘤负荷较大的情况下则难以达到满意的抑瘤效果。
[0008] 因此，需要研发新型的抗肿瘤复合制剂，切实增加药物抗肿瘤效果；同时，对于抗 肿瘤制剂，还需要具有体内长循环能力、可有效浓集于肿瘤部位。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种多重靶向抗肿瘤复合制剂及其制备方法。
[0010] 本发明研发的多重靶向抗肿瘤复合制剂由Fu泡囊、DOX-BSA和FA-DOX制成，基于 载药微粒的EPR效应、配体-受体和抗原-抗体特异性靶向作用，联合被动靶向给药系统和 免疫治疗，并辅助主动靶向分子治疗，实现更加高效地治疗癌症的目的。在免疫治疗前期介 入Fu泡囊给药系统抑制肿瘤的发展进程，防止肿瘤过度发展，提高治疗效果，克服了现有 肿瘤疫苗开发成本高昂且肿瘤细胞有免疫逃逸特性的缺陷。
[0011] 为达到上述目的，本发明采取的技术方案是， 一种多重靶向抗肿瘤复合制剂，由Fu泡囊混悬液、DOX-BSA以及FA-DOX组成； 所述Fu泡囊混悬液中，Fu泡囊的粒径为220~250nm，包封率为30~35%，表面固有 水化层厚度为1. 8~I. 9nm，载药率为12~15%，Zeta电位为-65~_70mV; 所述Fu泡囊的囊壁由普朗尼克-胆固醇化合物，失水山梨醇棕榈酸单酯（Span40)、失 水山梨醇硬脂酸单酯（Span60)及胆固醇（Chol)在缓冲液中自组装聚集而成；囊芯为氟尿 嘧啶； 所述DOX-BSA的结构式为：
[0012] 上述技术方案中，所述普朗尼克-胆固醇化合物的结构式为：
[0013] 上述技术方案中，所述Fu泡囊混悬液中，Fu含量为4. 0mg?ml1C3
[0014] 本发明的Fu泡囊的囊壁由普朗尼克-胆固醇化合物、失水山梨醇棕榈酸单酯 (Span40)、失水山梨醇硬脂酸单酯（Span60)及胆固醇（Chol)在缓冲液中自组装聚集而 成；普朗尼克-胆固醇、2种Span都是表面活性剂(两亲性)，与亲脂性的胆固醇，制成有机 溶剂的溶液，遇水后疏水部分自动聚集，亲水链舒张于水中，混在有机相的药物在各成分的 疏水作用作有序排列时被包载双分子夹层中，其中的胆固醇可提高双层膜的性质，普朗尼 克-胆固醇是用亲脂性的胆固醇对原来亲水性的表面活性剂普朗尼克性质的调整，提高了 其亲脂性，从而有利于与亲脂性的表面活性剂Span、亲脂性物质胆固醇在自组装时因疏水 作用而聚集形成泡囊。Fu泡囊混悬液为有机相加入PBS中，最后挥发有机溶剂制得，包括磷 酸盐缓冲液与Fu泡囊。
[0015] 本发明的新型泡囊给药系统，首次以普朗尼克F127-胆固醇与失水山梨醇棕榈酸 单酯（Span40)、失水山梨醇硬脂酸单酯（Span60)及胆固醇（Chol)包载水溶性药物5-氟尿 嘧啶（Fu)，化学稳定性优于脂质体，得到的Fu泡囊粒径降低至220~250nm，包封率为30~ 35%，表面固有水化层厚度为L8~I. 9nm(现有技术最大〈1. 5nm)，载药率为12~15%，Zeta 电位为-65~70mV;其粒径小、表面水化层厚且包封率相对较高，可规避机体内皮网状系统 拦截而不伤害正常组织，实现血中长循环，并通过EPR效应对肿瘤组织产生被动靶向作用； Fu经泡囊包载后，可以减缓药物的代谢，延长半衰期，通过确切的靶向作用提高疗效，从而 可降低给药剂量，减少毒副作用，为疗效确切的Fu解决了半衰期短、作用缺乏靶向性的缺 陷。
[0016] 本发明还公开了上述多重靶向抗肿瘤复合制剂的制备方法，包括以下步骤： (1) 将普朗尼克F127、乙酸酐和二甲亚砜混合，反应得到反应混合物；然后将反应混 合物滴入无水乙醚中；再加入二氯甲烷，振摇，再加入乙醚，静置，然后抽滤，滤饼为普朗尼 克F127-醛；将普朗尼克F127-醛、胆固醇、浓盐酸加入无水乙醇中，回流反应；然后反应 液经抽滤，得到蜡状固体；然后将蜡状固体置于NaOH溶液中浸泡后抽滤，滤饼为普朗尼克 F127-胆固醇；将普朗尼克F127-胆固醇、失水山梨醇棕榈酸单酯、失水山梨醇硬脂酸单酯 及胆固醇加入无水乙醇和乙酸乙酯中，加盖密闭，搅拌溶液至澄清；然后开盖加入Fu，盖上 密闭，搅拌分散或溶解；然后开盖加入预热的磷酸盐缓冲液，上盖密闭乳化，最后在搅拌下 挥发去除有机溶剂，得到Fu泡囊混悬液；乳化时的搅拌速度为1200~1300rmin%挥发 去除溶剂时的搅拌速度为700~800r?minS (2) 将BSA加入PBS溶液中，得到BSA溶液；将DOX'HCl溶解于DMF中，得到DOX溶液； 混合BSA溶液与DOX溶液，然后以3~5滴/min的滴速滴加戊二醛溶液，室温下避光反应； 反应完成后于4°C下离心处理，取上清，于4°C下，用PBS溶液透析；透析完成后，转出透析袋 中的溶液，冻干即为DOX-BSA; 所述PBS溶液的浓度为0.Imol/L;所述戊二醛溶液中戊二醛的质量浓度为22~28% ; 所述BSA、D0X'HC1、戊二醛的质量比为1 : (50~90) : (6~8); (3)将DMF加入盛有FA的容器中，得到FA溶液；将NHS和DCC分别溶解于DMF中，得 到NHS溶液以及DCC溶液；混合FA溶液、NHS溶液以及DCC溶液，避光反应10~16小时； 反应液离心处理后收取上清液；取DOXJCl溶解于DMF中得到DOX溶液；将DOX溶液滴加入 所述上清液中，室温下避光反应5~8小时；反应完成后，离心处理反应液，取上清；上清经 无水甲醇/乙醚混合液沉淀；收取沉淀，冻干即为FA-DOX;所述FA、NHS、DCC、DOX'HCl的摩 尔比为1 : (4~6) : (4~6) : (1.2~1.5);所述无水甲醇/乙醚混合液中无水甲醇、 乙醚的质量比为30 : 70 ; 所述Fu泡囊混悬液、DOX-BSA以及FA-DOX组成多重靶向抗肿瘤复合制剂。
[0017] 上述技术方案中，步骤（1)中，普朗尼克F127-胆固醇加入无水乙醇和乙酸乙酯前 经过纯化处理，具体为滤饼用氯仿溶解后装入截留分子量为3500的透析袋中，依次以80 % 的甲醇溶液、50 %的甲醇溶液、30 %的甲醇溶液、蒸馏水分别透析；最后将透析袋内的溶液 转出，冷冻干燥得到纯化的普朗尼克F127-胆固醇；失水山梨醇棕榈酸单酯、失水山梨醇硬 脂酸单酯加入无水乙醇和乙酸乙酯前分别经过纯化处理，具体为失水山梨醇棕榈酸单酯、 失水山梨醇硬脂酸单酯分别用氯仿溶解后分别装入截留分子量为3500的透析袋中，依次 以80%的甲醇溶液、50%的甲醇溶液、30%的甲醇溶液、蒸馏水分别透析，最后将透析袋内的 溶液转出，冷冻干燥得到纯化的失水山梨醇棕榈酸单酯、纯化的失水山梨醇硬脂酸单酯；加 入Fu，密闭后拌匀的具体方式为。
[0018] 上述技术方案中，步骤（1)具体为将普朗尼克F127、乙酸酐和二甲亚砜混合，室 温反应30h得到反应混合物；然后将反应混合物滴入无水乙醚中，有沉淀析出；再加入二 氯甲烷，充分振摇使溶液均相，再加入乙醚，4°C静置12~24小时；然后抽滤混合物，滤饼 真空干燥得到普朗尼克F127-醛；将普朗尼克F127-醛、胆固醇、浓盐酸加入无水乙醇中， 回流反应2. 5小时；然后反应液经抽滤，水洗除酸，得到蜡状固体；然后将蜡状固体置于浓 度为0.IM的NaOH溶液中浸泡后抽滤，滤饼为载体材料普朗尼克F127-胆固醇；将普朗尼 克F127-胆固醇、失水山梨醇棕榈酸单酯（Span40)、失水山梨醇硬脂酸单酯（Span60)