纤蛋白蛋白变体及相应的核酸序列的利记博彩app
【专利说明】纤蛋白蛋白变体及相应的核酸序列
[0001] 本申请要求于2013年4月2日提交的美国临时专利申请序列号61/807445的权 益，并在此通过引用将其整体并入。 发明领域
[0002] 本发明的实施提供纤蛋白3(也称为含EGF的纤蛋白样胞外基质蛋白1 (EFEMP1)) 的多肽的变体，和其编码的核苷酸序列，其特征在于抑制癌细胞生长，抑制癌细胞侵袭，以 及抑制癌症复发的一种或多种抗癌功能。
[0003]发明背景
[0004] 纤蛋白属于分泌糖蛋白，有七种类型。其共同特点是拥有多个类表皮生长因子 (EGF)模块和一个独特的C端模块。研究纤蛋白对癌症的功能表明，一些类型的纤蛋白具有 抑癌活性，也有一些具有致癌活性。此外，一些类型的纤蛋白（如纤蛋白3/EFEMP1)即有肿 瘤抑制活性也有致癌活性，取决于具体细胞组织特性。
[0005] EFEMP1肿瘤抑制功能列举如下。EFEMP1具有通过抑制内皮细胞出芽而达到的抗 新血管生成作用。EFEMP1过高表达有抑制纤维肉瘤细胞成瘤的功能。EFEMP1过低表达和 /或EFEMP1启动子甲基化在肺癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌和鼻咽癌中普片发生。 EFEMP1在胶母细胞瘤，肝癌和鼻咽癌中的表达与预后有良好的正相关性。在鼻咽癌和胶母 细胞瘤的细胞系中，EFEMP1抑制AKT信号通路传导。
[0006] EFEMP1致癌功能列举如下。EFEMP1在子宫颈癌，乳房癌中过高表达和不良预后相 关。在胰腺癌细胞，EFEMP1过度表达促进其异种成瘤并激活AKT信号通路传导。在某些神 经胶质瘤细胞，EFEMP1增强体外底物特异性的细胞粘附并促进细胞运动性和侵袭性。
[0007] 胶母细胞瘤（GBM)是一致命的原发性脑肿瘤。目前还没有任何有效的治疗。其不 同亚群细胞具有不同的增殖和侵袭能力。尽管经过手术，放疗和化疗，绝大多数GBM会复 发。复发的机理尚未确定。据推测，复发源于GBM中一群具有神经干细胞特性的细胞亚群 (所谓的肿瘤干细胞），有强的侵袭性并耐辐射和化疗。GBM生长似乎在很大程度上依赖于 新血管增生的肿瘤微环境。抗新血管增生的疗法已显示出暂时抑制的GBM肿瘤生长的疗 效。但抗血管增生疗法不能延长GBM患者的存活时间，复发的肿瘤有肿瘤侵袭增强的征兆。 此前，靶向治疗神经胶质瘤细胞侵袭有所欠缺。 发明概要
[0008] 在过去的30年中，GBM癌症患者手术后增加伴随替莫唑胺治疗，放射治疗，其生存 期中位数只增加了 2. 5个月。本发明的目的是提供一种癌症疗法，通过抑制癌细胞的生长， 侵袭，和/或癌症复发，例如治疗GBM。因此，本发明实施例提供了 EFEMP1变体，特征为在 肿瘤细胞中通过调节一些蛋白的活性和/或表达水平，包括表皮生长因子受体（EGFR)及 AKT，蛋白质酪氨酸激酶2 (PTK2)，和NOTCH。该癌症可以是低到中等级别胶质瘤，高级别胶 质瘤，如GBM，纤维肉瘤，结肠直肠癌，肺癌，结肠癌，肝癌，乳腺癌，前列腺癌，或鼻咽癌。并且 癌症细胞可以是肿瘤干细胞和非干细胞样癌细胞。
[0009] 本发明的某些实施例提供的多肽：（i )包含其氨基酸序列共享至少约70%，约 75%，约 80%，约 85%，约 90%，约 95%，约 97%，约 99%，或 100%与在 SEQ ID N0 :1 所显 示的氨基酸序列相同；和（ii )具备至少一种抗癌行为，包括抑制癌细胞侵袭，肿瘤生长，和 癌症复发。本发明的一些实施例包括提供对于这样的多肽进行编码的核苷酸序列的核酸分 子。
[0010] 本发明的某些实施例提供的多肽：（i )包含其氨基酸序列共享至少约85%，约 90%，约95%，约97%，约99%，或100%与在SEQ ID N0 :1或SEQ ID N0 :2所显示的氨基 酸序列相同，和（ii )具备至少一种抗癌行为，包括抑制EGFR表达，抑制EGFR活性，抑制 AKT表达，抑制Akt活性，抑制PKT2表达，抑制PKT2活性，抑制NOTCH表达，和抑制NOTCH活 性。本发明的一些实施例提供了对于这样的多肽进行编码的核苷酸序列的核酸分子。
【附图说明】
[0011] 图1A是人的纤蛋白组成员的Clustal W氨基酸序列的比对，包括EFEMP1，EFEMP2 和纤蛋白5(FBLN5)。图1B是比较人，小鼠，和大鼠的EFEMP1的EGFR同源区域（EHR)氨基 酸序列，以及相应的人的4个EGFR亚型和EGFR缺失突变体中EHR的氨基酸序列。
[0012] 图 2 是 EFEMP1，FLAG 标记 EFEMP1 (E1)及其蛋白变体（E2-E11，E13-E15, E18)的 蛋白模块化结构的概略。
[0013] 图3A是肿瘤重量曲线图，来自例4中所述的皮下（SC)异种移植实验，由皮下注入 U251细胞株⑵及由p⑶NA 3. 1质粒载体稳定转化株，如图2和例1所述，表达FLAG标记 的EFEMP1及其变体（E1-E3, E6-E7, E10-E11，E13, E15)。图3B是肿瘤重量曲线图，来自例 4中所述的SC异种移植实验，由皮下注入U251细胞株，稳定转染了如图2和例1中所述 中描述的慢病毒PTRIPZ空载体（Vec)及表达FLAG标记EFEMP1及其变体（E1-E3, E6-E7， E10-E11，E13, E15)〇
[0014] 图4A是transwell底部表面的照片，来自例5中描述的基质胶细胞侵袭测定实 验，用U251细胞株（P)及由p⑶NA 3. 1质粒载体稳定转化株，如图2和例1所述，表达E1， E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, Ell，E13, E14, E15 和 E18,以及空载体 pcDNA 3. 1+ (Vec)。 图4B是一个细胞侵袭性图，来自例5中描述的基质胶侵袭测定实验，用U251神经球细胞株 (U251-NS)，及由pTRIPZ慢病毒稳定转染株，如图2和例2所述，表达El，E2, E3, E5, E7， E8, E10, Ell，E13, E15和E18,以及空载体pTRIPZ (Vec).图4C是例6中所述的两组明胶酶 谱照片，样本来自图4B基质胶侵袭测定实验的细胞分泌到基本培养液中的蛋白。
[0015] 图5是一组免疫印迹照片，来自例7中所描述分析U251细胞株⑵及其稳定转染 株的免疫印迹实验，转染株来自细胞感染了如图2和例1所述的E1，E2，E5和ElOpTRIPZ慢 病毒。
[0016] 图6是裸鼠生存曲线图。来自例8中所述的颅内（1C)异种移植实验，颅内注入 U251神经球培养的细胞（U251-NS)及其稳定转染株，用如图2和例1中所述中描述的慢病 毒pTRIPZ空载体（Vec)及表达FLAG标记EFEMP1 (E1)及其变体（E2, E5)。
[0017] 本发明的详细描述
[0018] 通过本发明的实施目的在于提供一 EFEMP1变体的氨基酸序列，该蛋白具备抑制 癌症的功效，如在神经胶质瘤（例如，多形胶质母细胞瘤）中，表现至少一种如下功能：抑制 活性癌细胞生长，抑制癌细胞侵袭，抑制癌复发。在本发明的描述中，氨基酸序列的EFEMP1 变体在某些地方被称为EFEMP1衍生肿瘤抑制蛋白（ETSP)，分别和共同抑制神经胶质瘤各 亚群细胞的增殖和侵袭及异种移植肿瘤原位生长。ETSP的发现，至少部分，通过EFEMP1氨 基酸序列同源性研究及用功能实验手段研究各个EFEMP1变体在神经胶质瘤肿瘤各亚群细 胞表达的结果。
[0019] 图1A是人的纤蛋白组成员的Clustal W氨基酸序列比较，包括EFEMP1，EFEMP2 和纤蛋白5 (FBLN5)。这表明，虽然EFEMP1的蛋白序列比EFEMP2和FBLN5都长，它们的序 列相似程度很高。图1A还分别显示EFEMP1和FBLN5的弱（RGE)和强（R⑶）的整联蛋白 (Integrin)结合位点的位置。图1B是CLUSTAL W氨基酸序列比较，比较一段EFEMP1上由 38个氨基酸组成的EGFR同源区域（EHR)。参与比较的氨基酸序列包括：人，小鼠，和大鼠 EFEMP1中的EHR;4个人类表皮生长因子受体（EGFRvl，EGFRv2, EGFRv3, EGFRv4)亚型；和 在癌细胞中发现的EGFR缺失突变体（EGFRvIII)。
[0020] 图2是蛋白模块化结构的概略，描述EFEMP1，FLAG标记的EFEMP1及其变体 (E1-E11，E13-E15,和E18)的蛋白结构。构建体E1编码具有野生型全长EFEMP1的氨基酸 序列，它包括一个信号肽，一个DSL模块，一带有插入的EGF样模块，五个编号1-5的EGF样 模块，和一个纤蛋白型模块。
[0021] 构建体E2编码其中的氨基酸81-172已被删除的一个EFEMP1变体，在很大程度上 消除了 EFEMP1特异的有插入的EGF样模块。
[0022] 构建体E3编码其中的氨基酸379-493已被删除的一个EFEMP1变体，在很大程度 上消除了 EFEMP1的纤蛋白型模块。
[0023] 构建体E4编码一个EFEMP1变体，其中氨基酸186已经从丙氨酸转变为甘氨酸，将 EFEMP1的弱的整联蛋白结合位点转换成一个强的结合位点。
[0024] 构建体E5编码其中氨基酸379-493被删除的一个EFEMP1变体，基本上消除了 EFEMP1的纤蛋白型模块，并且将其中氨基酸210从谷氨酸转变为天冬氨酸，相应将EFEMP1 的一个弱的整联蛋白结合位点转换成一个强的结合位点。
[0025] 构建体E6编码其中氨基酸173-213和379-493被删除的一个EFEMP1变体，在很 大程度上消除了第一个EGF样模块和EFEMP1的纤蛋白型模块。
[0026] 构建体E7编码其中氨基酸173-213被删除一个EFEMP1变体，基本上消除了 EFEMP1的第一个EGF样模块。
[0027] 构建体E8编码其中氨基酸379-493被删除一个EFEMP1