短效因子vii多肽的利记博彩app
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请要求2012年12月24日提交的美国申请序号61/745, 674和2013年3月15日 提交的美国申请序号61/787, 026的优先权，它们在此通过引用整体并入。
技术领域
[0002] 本文中提供了人凝固因子VII变体和编码这样的变体的多核苷酸，包含和表达这 样的变体的载体和宿主细胞，得到这样的变体的方法，使用这样的变体的方法，所述变体的 组合物，和与之相关的额外发明特征。
【背景技术】
[0003] 血液凝固是由各种血液组分（或因子）的复杂相互作用组成的过程，所述复杂相 互作用最终产生纤维蛋白凝块。通常，参与已被称为凝固"级联"的血液组分是在酶促方面 失活的蛋白质（前酶或酶原），其通过活化剂（其自身是活化的凝固因子）的作用而转化成 蛋白水解酶。已经经历这样的转化的凝固因子一般被称为"活性因子"，并且通过向凝固因 子的名称添加字母"a"来命名（例如，因子Vila)。
[0004] 止血过程的开始由组织因子（其在血管壁损伤以后暴露于循环血液）和因子 Vila(其以对应于总因子VII蛋白质量的约1%的量存在于循环中）之间的复合物的形成介 导。该复合物锚定至带有组织因子的细胞并在细胞表面上将因子IX和X转化成它们的活 性形式因子IXa和因子Xa。因子Xa在带有组织因子的细胞上将凝血酶原转化成凝血酶，所 述凝血酶活化因子VIII、因子V、因子XI和因子XIII。此外，在止血的该初始步骤中形成的 有限量的凝血酶也活化血小板。在凝血酶作用于血小板以后，血小板改变形状并将带电荷 的磷脂暴露在它们的表面上。该活化的血小板表面形成其它因子X活化和完整凝血酶产生 的模板。在活化的血小板表面上的其它因子X活化经由在活化的血小板的表面上形成的因 子IXa和因子Villa复合物而发生，且因子Xa然后将凝血酶原转化成凝血酶，同时仍然在 表面上。凝血酶然后将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，所述纤维蛋白是不溶性的且稳定化最 初的血小板栓。该过程定位至组织因子暴露部位，由此使凝固系统的全身活化的风险最小 化。近年来，已经发现因子VII和组织因子是血液凝固的主要引发剂。
[0005] 因子Vila从它的前体因子VII产生，所述因子VII是在肝脏中合成并分泌进血液 中，它在血液中作为单链糖蛋白（约50, 000 Da的分子量）进行循环。本文中使用的野生 型因子VII具有在图1和2中公开的氨基酸序列和核苷酸序列。术语"因子VII"意在包括 处于它们的未切割形式（酶原形式）的因子VII多肽以及已经蛋白水解地或以其它方式加 工以产生它们各自的生物活性形式（其可以被称作因子Vila)的那些。野生型因子VII通 常在残基152和153之间被切割以产生因子Vila。
[0006] 因子VII在体外被因子Xa、因子Xlla、因子IXa或凝血酶转化成双链形式因子 Vila。象参与止血的几种其它血浆蛋白一样，因子VII的活性依赖于维生素K，其是簇集在 该蛋白的氨基端附近的多个谷氨酸残基的Y-羧基化所必需的。这些Y-羧化的谷氨酸是 金属离子诱导的因子VII与磷脂的相互作用所必需的。在有组织因子、磷脂和钙离子存在 下，双链因子Vila通过有限的蛋白酶解快速地活化因子X或因子IX。因子Vila易于发生 蛋白水解性裂解，从而产生许多不具有凝固活性的降解产物。
[0007] 已经公开了因子VII变体，其具有通过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入 而从野生型因子VII衍生出的氨基酸序列。例如，Dickinson等人（Proc. Natl. Acad. Sci USA (1996) 93，14379-14384)涉及因子 VII 变体，其中 Lysl57、Vall58、Glu296、Met298、 Asp334、Ser336 或 Lys227 已经个别地被 Ala 替换。Iwanaga 等人（Thromb. Haemost. (1999年8月增刊），466，摘要1474)涉及因子Vila变体，其中残基316-320缺失或残基 311-322被得自胰蛋白酶的对应残基替换。Bolt等人的美国专利申请公开2008/0058255 A1涉及在N145或N322处、或者在N145和N322二者处具有破坏糖基化的取代的因子VII 变体。Toso等人报道了一系列基于天然存在的突变的因子VII结构-功能研究。突变 体重组因子VII蛋白包括T324M、E385K和两种在因子VII重链（N322Q)或因子VII轻链 (N145Q)中缺少糖基化核心序列的突变体因子VII蛋白。Toso等人，"Lack of Heavy Chain Glycosylation in Patient with Factor VII Deficiency Not Responsible for Mutant FVIIa Activity,'Blood,第96 卷，第 11 期，第 2 部分（2000 年 11 月 16 日）， 第 79b 页（美国血液学会第 42 届年会（42nd Annual Meeting of the American Society of Hematology))。
[0008] 大多数天然存在的肽和蛋白含有碳水化合物部分，所述碳水化合物部分沿着肽或 蛋白主链的长度经由与选定数目的氨基酸的特定键而连接至所述肽或蛋白。因而，许多天 然存在的肽和蛋白分别被称作"糖肽"或"糖蛋白"。在任何给定的肽或蛋白上的糖基化模 式的变异性可以影响该肽或蛋白的功能。例如，在肽或蛋白上的N-连接的聚糖的结构可以 影响肽或蛋白的多种特征，包括蛋白酶易感性、细胞内运输、分泌、组织靶向、生物半衰期以 及所述肽或蛋白在细胞或生物体中的抗原性。这些特征中的一种或多种的改变可以影响肽 或蛋白在它的天然场合中的效力，且也可以影响肽或蛋白作为治疗剂的效力（在所述肽或 蛋白已经为该目的而制备的情况下）。
[0009] 与肽或蛋白链连接的碳水化合物结构被称作"聚糖"分子。存在于肽或蛋白上的 具体聚糖结构影响肽或蛋白的可溶性和聚集特征、肽或蛋白主链的折叠，且因此影响它的 功能或酶活性、肽或蛋白对蛋白水解性攻击的抵抗力、以及导致无活性形式的肽或蛋白向 活性形式的转化的蛋白酶解的控制。例如，存在于聚糖分子上的末端唾液酸残基影响肽或 蛋白在哺乳动物循环系统中的半衰期的长度。其聚糖不含有末端唾液酸残基的肽和蛋白通 常被肝脏更快速地从循环中除去。
[0010] 在天然存在的糖肽和糖蛋白中发现的聚糖结构通常分成两类：N-连接的聚糖和 〇-连接的聚糖。野生型因子Vila含有两个N-连接的糖基化位点和两个0-连接的糖基化 位点。N-连接的糖基化是在真核生物中最常见的共价修饰。N-连接的糖基化发生在共有 序列Asn-X-Ser/Thr处，在该处聚糖连接至天冬酰胺的胺基，且X代表除了脯氨酸以外的任 何氨基酸。N-连接的聚糖是基于共同核心戊糖Man 3(GlcNAc)2，其可以通过添加单糖（诸如 N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰基葡糖胺、果糖、甘露糖和岩藻糖）而进一步 修饰。具有不同单糖（包括末端唾液酸）的Man 3(GlcNAc)^心可以经由N-乙酰基葡糖胺 连接在Asn-X-Ser/Thr共有序列的Asn处。该化学上复杂的共翻译修饰用于多个目的，并 以多种方式（包括适当折叠、官能团取向和清除率）影响蛋白的生物学。
[0011] 在本领域中已经提出了多种定制肽或蛋白的糖基化模式的方法，包括在DeFrees 等人的美国专利号8, 008, 252中描述的那些。
[0012] 经常期望，刺激或提高受试者中的凝固级联。已经使用因子Vila来控制由凝固因 子缺乏（例如，A和B型血友病，或凝固因子XI或VII的缺乏）或凝固因子抑制剂造成的出 血障碍。重组因子Vila(由Novo Nordisk在商业名称NovoSeven?下制造和销售）被批准 用于治疗具有因子VIII或因子IX的抑制剂的A或B型血友病患者中和具有获得性血友病 的患者中的出血发作；预防具有因子VIII或因子IX的抑制剂的A或B型血友病患者中和 具有获得性血友病的患者中在外科手术干预或侵入性手术中的出血；治疗具有先天性因子 VII缺乏的患者中的出血发作和预防具有先天性因子VII缺乏的患者中在外科手术干预或 侵入性手术中的出血。Hedner的美国专利号5, 180, 583公开了使用因子Vila来控制并非 由凝固因子缺陷或凝固因子抑制剂造成的情形下的过度出血。Hedner公开了治疗例如由缺 陷性血小板功能、血小板减少症或冯威里氏病造成的出血障碍和用于那些用途的组合物。
[0013] 需要治疗并非由先天性的或发展的凝固因子缺乏或凝固因子抑制剂引起的障碍 的出血。几个临床试验已经证实了重组因子Vila用于控制出血的效力。但是，存在关于使 用该分子引起的不希望的血栓栓塞性事件的增加的担忧。出血在许多障碍中是一个重大问 题，诸如关于外科手术、外科手术以后的并发症、干（stem)和器官移植物、颅内出血、主动 脉瘤和创伤或某些抗凝剂的剂量过量。
【发明内容】
[0014] 一个目的是用短效的因子VII多肽治疗出血障碍和发作。本工作的一个目的是， 提供短效的因子VII多肽（野生型或变体）的组合物，其特征在于一个或多个药代动力学 特性，诸如缩短的半衰期。一个目的是提供这样的因子VII分子，其在靶位和治疗时间范围 以外具有减小的血栓性事件的机会。一个目的是提供由于改变的糖基化模式而具有增强的 清除率的因子VII多肽（野生型或变体）。
[0015] 本文描述了变体因子VII多肽的组合物，其中所述变体因子VII多肽包含与SEQ ID N0: 16的氨基酸序列相比具有至少2个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少2个序列 改变是（1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和（2)谷氨酸残基取代位置32的赖 氨酸残基；且其中所述组合物中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率 小于0. 05、小于0. 1、小于1. 0、小于2. 0、小于3. 0、小于4. 0、小于5. 0或小于6. 0。本文还 描述了变体因子VII多肽的组合物，其中所述变体因子VII多肽包含与SEQ ID N0: 16的 氨基酸序列相比具有至少2个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少2个序列改变是（1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和（2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基；且 其中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率是在选自以下的范围内：（1) 0-5; (2) 0-4; (3) 0-3; (4) 0-2; (5) 0-1 和（6) 0-0.5。
[0016] 本文还描述了一种分离的变体因子VII多肽，其包含与SEQ ID N0: 16的氨基酸 序列相比具有至少2个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少2个序列改变是（1)谷氨酰 胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和（2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，其中所述 多肽具有小于〇. 05、小于0. 1、小于1. 0、小于2. 0、小于3. 0、小于4. 0、小于5. 0或小于6. 0 的缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率。本文还描述了因子VII多肽的 组合物，其中所述因子VII多肽包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列（野生型因子VII)且所 述组合物中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率是在选自以下的范围 内：⑴1-5;⑵1-4; (3) 1-3;⑷1-2;和（5) 0.5-1;或缀合的唾液酸是不可检测的。
[0017] 本文还描述了一种分离的变体因子VII多肽，其选自： (1) 多肽，其包含与SEQ ID N0: 16的序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列， 其中所述序列改变由以下组成：（1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，（2)谷氨酸 残基取代位置32的赖氨酸残基，和（3)使得在位置145处的N-连接的糖基化被破坏的序 列改变； (2) 多肽，其包含与SEQ ID N0: 16的序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列， 其中所述序列改变由以下组成：（1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，（2)谷氨酸 残基取代位置32的赖氨酸残基，和（3)使得在位置322处的N-连接的糖基化被破坏的序 列改变； (3) 多肽，其包含与SEQ ID N0: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基 酸序列，其中所述序列改变由以下组成：（1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和 (2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，和（3)使得在位置145和322处的N-连接的 糖基化被破坏的序列改变； (4) 多肽，其包含与SEQ ID N0: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基 酸序列，其中所述序列改变由以下组成：（1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和 (2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，其中位置145和322是天冬酰胺且具有连接的 N-连接的糖基化； (5) 多肽，其包含与SEQ ID N0: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基 酸序列，其中所述序列改变由以下组成：（1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，（2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，（3)谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，（4)谷 氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和（5)使得在位置145处的N-连接的糖基化被破坏 的序列改变； (6) 多肽，其包含与SEQ ID N0: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基 酸序列，其中所述序列改变由以下组成：（1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，（2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，（3)谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，（4)谷 氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和（5)使得在位置322处的N-连接的糖基化被破坏 的序列改变； (7) 多肽，其包含与SEQ ID N0: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基 酸序列，其中所述序列改变由以下组成：（1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，（2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，（3)谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，（4)谷 氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和（5)使得在位置145和322处的N-连接的糖基化 被破坏的序列改变；和 (8) 多肽，其包含与SEQ ID N0: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基 酸序列，其中所述序列改变由以下组成：（1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，（2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，（3)谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，和（4) 谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，其中位置145和322是天冬酰胺且具有连接的N-连 接的糖基化。
[0018] 本文还描述了具有减少的唾液酸与因子VII多肽的缀合的因子VII多肽。在某些 实施例中，所述因子VII多肽是产生改变的糖基化模式的变体多肽。在其它实施例中，所 述因子VII多肽是具有减少的唾液酸缀合的野生型因子VII多肽。在某些实施方案中，减 少的唾液酸缀合可以通过用唾液酸酶处理多肽来实现。在其它实施方案中，减少的唾液酸 缀合可以如下实现：在部分地或完全地缺乏肽的唾液酸化的细胞系中生产重组因子VII多 肽。在其它实施方案中，减少的唾液酸缀合可以如下实现：在细胞系中共表达重组因子VII 多肽和重组的或外源的唾液酸酶。
[0019] 还描述了一种用于治疗患有需要血块形成的疾病或障碍的哺乳动物的方法，所述 方法包括：给有此需要的哺乳动物施用有效量的具有减少的唾液酸缀合的因子VII多肽。 在某些实施方案中，缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率小于0. 05。在 其它实施方案中，所述因子VII多肽包含SEQ ID N0: 16的氨基酸序列。在其它实施方案 中，所述因子VII多肽包含野生型因子VII。在其它实施方案中，要治疗的疾病或障碍选自： 出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲 张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。
[0020] 在下面详细公开了其它变体、组合物、方法和有关的产品和工艺。
【附图说明】
[0021] 图1A-1H显示了在本申请中使用的三种因子VII分子的核苷酸序列。"VI"是与 SEQ ID N0: 16的野生型人氨基酸序列相比具有4个氨基酸突变的人因子VII变体：(P10Q、 K32E、T106N和V253N)。"V2"是与SEQ ID NO: 16的野生型人氨基酸序列相比具有6个氨 基酸突变的人因子￥11变体：（？100、1(32￡、六34￡、1?36￡、1'106~和￥253吣。图1还显示了在 实施例中使用的各种构建体的核苷酸序列。
[0022] 图2显示了在本申请中使用的三种因子VII分子的氨基酸序列。本文中使用的野 生型人因子VII具有SEQ ID N0: 16的氨基酸序列。VI具有SEQ ID N0: 17的氨基酸序 列。V2具有SEQ ID N0: 18的氨基酸序列。在VI和V2中，SEQ ID N0: 16的野生型因子 VII的变化以粗体显示。
[0023] 图3的图示描绘了在本申请的实施例中使用的三种因子VII分子。显示了聚糖在 N-糖基化位点处的连接。为了描述聚糖，实心框代表N-乙酰基葡糖胺，带阴影的椭圆形代 表甘露糖，空心椭圆形代表半乳糖，黑色菱形代表唾液酸（也被称作N-乙酰基神经氨酸）， 且封闭的三角形代表岩藻糖。用聚糖的一种可能变体描绘聚糖结构，且不代表实际测量的 聚糖。
[0024] 图4的图示描绘了 N-连接的聚糖，其显示了在Asn-X-Ser/Thr共有序列中的Asn 处的连接。显示了具有不同单糖（包括末端唾液酸）的Man 3(GlcNAc)2核心。
[0025]图5的图示描绘了参考V2举例说明的在本公开内容中使用的两个方案，其用于减 小因子VII变体的半衰期。
[0026] 图6是低糖基化的因子VII分子的表格。
[0027] 图7显示了根据实验条件去唾液酸化以后，用LC-MS方法鉴别在V2的重链上剩余 的唾液酸的结果。
[0028] 图8显示了去唾液酸化的V2的唾液酸含量分析。
[0029] 图9显示了磷脂FX活化测定的结果。
[0030] 图10显示了关于去唾液酸化的蛋白的PL-TGA测定的结果。
[0031] 图11显示了低糖基化的因子VII变体的表达。
[0032] 图12的表格显示了使用转染上清液确定低糖基化的FVII变体的"比活性"。
[0033] 图13显示了关于纯化的低糖基化的变体pMB121的PL-TGA测定的结果。
[0034] 图14显示了去唾液酸化的V2相对于野生型因子VII的体外肝细胞清除。
[0035] 图15显示了使用因子VII变体的体外肝细胞清除的结果。低糖基化的变体在该 模型中没有显示出清除的增加。该结果提示这些分子的清除机制不同于去唾液酸化的V2 所利用的清除机制。
[0036] 图16显示了在大鼠中的药代动力学研究结果。如通过因子VII ELISA所测得的， 在Sprague Dawley大鼠中，去唾液酸化的V2和VI的半衰期显著低于它们的未修饰的母体 分子。
[0037] 图17显示了在HemA小鼠中的药代动力学研究结果。
[0038] 图18显示了在HemA小鼠中的去唾液酸化的V2效力研究。
[0039] 图19显示了在TVT HemA模型中的去唾液酸化的V2效力研究。
[0040] 图20显示了与因子VII相比，用去唾液酸化的V2在HemA小鼠中制备凝血酶-抗 凝血酶（"TAT"）的结果。
[0041] 图21显示了在凝固活性的小鼠中的去唾液酸化的V2效力研究。
[0042] 图22显示了与具有正常唾液酸缀合的野生型因子VII相比，去唾液酸化的野生型 因子VII (dWT Vila)的体外肝细胞清除。
[0043] 图23显示了与野生型因子VII相比，在人组织因子敲入（knock-in) (TFKI)小鼠 中关于dWT Vila的尾巴切割研究结果。发现去唾液酸化的因子VII比野生型因子VII明 显更有效。
[0044] 图24显示了施用dWT Vila或野生型因子VII以后，凝血酶-抗凝血酶（TAT)复 合物的ELISA分析的结果。
[0045] 图25显示了在？冗13血栓形成模型中血栓形成分析的结果。与野生型因子VII相 比，给定剂量的dWT Vila产生了极大减少的血栓形成。
[0046] 图26显示了用发荧光的底物测得的，dWT Vila和野生型因子VII对可溶性组织 因子的表观结合亲合力。
[0047] 图27显示了可溶性组织因子与dWT Vila或野生型因子VII的复合物将因子X转 化为因子Xa。
【具体实施方式】
[0048] 本文描述了用于调节重组因