一种无细胞基质生物材料的制备方法和用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无细胞基质生物材料的制备方法。
【背景技术】
[0002]干细胞是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞，是细胞移植组织再生及修复的理想细胞。虽然胚胎干细胞是最原始的及最有分化潜能的干细胞，但目前来源十分有限。而经过高表达干细胞因子诱导的干细胞也称iPS细胞虽然具有诸多胚胎干细胞的特性，但因制备方法复杂，还涉及到使用病毒载体等安全性问题，目前临床应用还存在很多瓶颈。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群，如骨髓干细胞、脂肪干细胞、脐带血干细胞等。MSC来源丰富，比如可以取材于身体上多余的脂肪、游离方法简便、具有自我更新及多潜能分化能力，是一种理想的组织再生和修复材料。
[0003]目前已有异种脱细胞基质材料用于临床。因为经过脱细胞处理，材料内不存在异种细胞，这样将避免了人体对异种材料产生的免疫反应。但因为没有细胞成分，脱细胞基质材料因此是缺乏生物活性的材料，其对创伤、组织缺损等的修复作用有限。间充值干细胞大量存在于组织中，如来源于脂肪组织的脂肪干细胞，来源于骨髓的骨髓干细胞等。骨髓干细胞已用于临床治疗各种血液病多年，即骨髓移植。干细胞用于组织器官修复的细胞治疗目前存在诸多问题，虽然有临床应用报道，临床效果不确定。特别是用于外表创伤修复、或者损伤组织或器官的替代，如果没有细胞外基质材料的支撑，干细胞很难发挥作用。
【发明内容】
[0004]本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个目的在于提供了一种无细胞基质生物材料的制备方法。
[0005]现有的脱细胞基质材料采用异种皮经脱细胞处理，使之成为不具抗原性的生物材料。由剩下的细胞外基质材料(主要由胶原和弹性蛋白组成)提供组织创面的覆盖，提供组织修复的支架而在临床应用中有一定的价值。但由于这种基质材料缺乏应有的和组织修复有关的细胞因子，其用途及有效性受到很大影响。间充值干细胞如游离自脂肪的脂肪干细胞具有多分化潜能，被认为是有用的细胞治疗手段。但干细胞单独在体内应用存在诸多问题，如干细胞需要细胞外基质的支持，才能更好地成活。基于上述理由，本发明结合无细胞基质材料和间充值干细胞技术提供一种有生物学活性的生物材料，该生物材料可用于各种组织的再生和修复，特别是创伤愈合、减少疤痕形成、皮肤再生、尿道替代、膀胱替代等。该发明描述的间充值干细胞的分离技术和脱细胞基质生物材料的制备技术也可以单独使用。
[0006]需要说明的是，本发明是基于发明人的下列技术而完成的:
[0007]根据本发明的一个方面，本发明提供了一种无细胞基质生物材料的制备方法，包括以下步骤:
[0008]步骤S1:获取组织，所述组织来源于动物体；
[0009]步骤S2:脱细胞处理，将所述组织进行脱细胞处理；
[0010]步骤S3:灭菌处理；
[0011 ] 步骤S4:收获脱细胞基质材料；
[0012]步骤S5:获取脂肪组织，所述脂肪组织来源于动物体；
[0013]步骤S6:游离脂肪干细胞；
[0014]步骤S7:收获脂肪干细胞；
[0015]步骤S8:种植脂肪干细胞，将所述脂肪干细胞种植在脱细胞基质材料中，培养；
[0016]步骤S9:收获无细胞基质生物材料。
[0017]另外，根据本发明上述实施例一种无细胞基质生物材料的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征:
[0018]所述步骤SI中的组织为真皮组织或者膀胱组织中的一种。
[0019]根据本发明的实施例，所述脱细胞处理包括以下步骤:将步骤SI中的组织放置在培养皿中，加入胰酶，EDTA和Triton X-100 ;37度震荡消化3_4小时；PBS浸洗后，加入
0.1 %叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水，培养5分钟?3天；
[0020]任选地，所述胰酶的浓度为0.125% ；
[0021 ] 任选地，所述EDTA为ImM ；
[0022]任选地，所述Triton X-100的浓度为0.25%。
[0023]根据本发明的实施例，所述灭菌处理为gamma射线照射。
[0024]根据本发明的实施例，所述游离脂肪干细胞包括以下步骤:将脂肪组织放置在培养皿，加入I %青霉素和链霉素的PBS，浸洗；用刀片将组织切成Imm见方的小块，加入含
0.075%的IA型胶原酶；37度摇床孵化I小时；室温250°C离心10分钟，去除上面两层，保留细胞层；加入 200mg/mL KH2PO4、200mg/L KCU2.16g/L Na2HPO4.7H20、8g/L NaCl, 30, 000单位/L S0D、5g/L人血清白蛋白，重悬细胞；
[0025]任选地，所述脂肪组织与IA型胶原酶的比例为1-5:1。
[0026]根据本发明的实施例，所述种植脂肪干细胞包括以下步骤:
[0027]将步骤S4收获的脱细胞基质裁剪成2x2mm的小片，PBS浸泡2小时候，离心，浸洗，平放在60_培养皿内，加入DMEM完全培养液至材料湿润；
[0028]将步骤S7收获的脂肪干细胞用DMEM完全培养液，所述DMEM培养液包括10 %胎牛血清和I %青霉素/链霉素)培养5-7天；
[0029]在裁剪好的每片基质材料上加500uL，5xl04悬浮的脂肪干细胞；
[0030]将培养皿放置37度CO2培养箱培养30分钟，然后加入2ml DMEM完全培养液；
[0031]继续培养48小时。
[0032]另一方面，本发明提供无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于组织损伤的再生和修复。
[0033]本发明提供无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于烧伤创面的覆盖和修复。
[0034]本发明提供无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于膀胱的修复。
[0035]本发明提供无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于尿道替代。
[0036]本发明的技术效果为:
[0037]I)自身间充值干细胞如脂肪干细胞来源丰富，获取方法简单；
[0038]2)自身间充值干细胞具有多分化潜能性，能分化成各种胚层的细胞，如上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等；
[0039]3)间充值干细胞能分泌多种细胞因子，如血管生长因子、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子O3DGF)等，可以住进组织细胞再生；
[0040]4)因间充值干细胞取自自身，因此不具抗原性；
[0041]5)将脱细胞基质和自身干细胞结合能充分发挥二者的优点。
[0042]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0043]图1为本发明提供的一种无细胞基质生物材料的制备方法制备的生物材料用于膀胱修复的图
【具体实施方式】
[0044]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0045]脱细胞基质材料可来源于同种及异种组织，组织可以是皮肤组织、器官如膀胱、尿道、输尿管等。取决于被修复组织的性质而选取。组织的来源可以是人、大鼠、仓鼠、猪、狗、兔、牛等。
[0046]实施例1:基于真皮的脱细胞基质材料的制备:
[0047]I)皮肤取自上述动物皮肤，可以取自尸体及手术过程的多余皮肤；
[0048]2)分离表皮层与真皮层:将皮肤浸泡在0.25 %的胰酶及ImM的EDTA溶液中消化3个小时；
[0049]3)用机械方法将表皮层与真皮层分离；
[0050]4)脱细胞处理；
[0051]5)脱细胞溶液配制:0.125%胰酶、ImM EDTA、0.2