氯化血红素在制备预防和治疗脓毒症肌萎缩药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于脓毒症肌萎缩研究技术领域，具体涉及一种氯化血红素在制备预防和 治疗脓毒症肌萎缩药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肌萎缩是多种疾病或异常生理状况，如营养不良、长期卧床、失重、去神经化、高龄 等存在时，以骨骼肌重量和体积减少，肌纤维横截面积变小为特征的并发症。肌萎缩临床多 表现为肌力下降或消失，严重影响患者的生活质量。肌萎缩的病因复杂多样，其具体病理 生理机制仍不清楚，肌纤维蛋白降解加速是目前公认的造成肌无力和肌萎缩的主要机制之 一。目前，针对肌萎缩的治疗手段主要以物理治疗为主，患病早期，在保证安全的前提下早 期下床活动是防止肌萎缩恶化的重要手段；对重症患者，肌肉电刺激疗法对肌肉含量和肌 力均有保护作用，可作为早期下床活动的替代治疗。然而，目前国内针对肌萎缩药物治疗的 相关研究较少。
[0003] 脓毒症是危重病患者发生肌萎缩的重要诱因之一。脓毒症可引起白介 素-1(11^1)、白介素-6(11^6)以及肿瘤坏死因子- &〇'即-(1)等促炎因子的分泌，促炎因子 使得微血管的通透性增加，导致血管-神经屏障被破坏。中性粒细胞激活后释放的大量蛋 白酶，更容易通过血-神经屏障，直接损伤神经轴突，破坏神经肌肉接头功能。
[0004] 此外，脓毒症时，体内主要介导蛋白降解的泛素-蛋白酶体系统 (ubiquitin-proteasome system, UPS)的活性增加，肌萎缩相关基因-I(Atrogin-I)和肌 肉环状指分子I(MuRFl)是UPS作用中两个重要的E3泛素连接酶，是蛋白降解系统中关键 的正性调节分子，多项研究发现脓毒症时骨骼肌中的Atrogin-I和MuRFl均有高表达；另 外，脓毒症时，机体内大量产生的活性氧（ROS)能改变以肌纤维蛋白为底物的激酶和磷酸 化酶的功能，影响其收缩功能。因此，抑制炎性因子的释放，降低UPS的活性和氧化应激的 水平，可能会成为脓毒症肌萎缩药物治疗的靶点。
[0005] 氯化血红素（Hemin)是血红素的体外纯化模式，可从动物体内提取，也可人工合 成。Hemin吸收利用率高，补铁效果好，临床多将其作为一种补铁药物或营养品有效成分，用 于缺铁性贫血的治疗。有研究表明，Hemin能诱导体内血红素氧合酶I (heme oxygenase-1， H0-1)的高表达，HO-I是体内血红素代谢的关键酶，可催化血红素降解为C0、胆绿素和Fe' 迄今为止，作为HO-I的底物和诱导剂，以Hemin为有效成分预防和治疗脓毒症肌萎缩的相 关研究和报道尚未发现。
【发明内容】
[0006] 本发明是为解决上述问题而进行的，提供了氯化血红素（Hemin)在制备预防和治 疗脓毒症肌萎缩药物中的应用。
[0007] 本发明的另一个目的是通过实验证实氯化血红素（Hemin)在治疗脓毒症肌萎缩 中存在有益效果，本发明通过以下实验证明氯化血红素（Hemin)的新用途：
[0008] 1、氯化血红素改善脓毒症小鼠后肢肌肉萎缩程度的实验（详见实施例一）；
[0009] 2、氯化血红素缓解脓毒症小鼠比目鱼肌湿重的下降程度的实验（详见实施例 二）；
[0010] 3、氯化血红素降低脓毒症小鼠比目鱼肌蛋白分解代谢速度的实验；（详见实施例 三） ；
[0011] 4、氯化血红素改善脓毒症小鼠胫骨前肌肌纤维横截面积的实验（详见实施例 四） ；
[0012] 5、氯化血红素减少脓毒症小鼠外周血IL-6, TNF-α的分泌水平的实验（详见实施 例五）；
[0013] 6、氯化血红素下调肌肉组织Atrogin-I和MuRFl的蛋白表达水平的实验（详见实 施例六）；
[0014] 7、氯化血红素降低骨骼肌丙二醛（MDA)浓度，上调超氧化物歧化酶（SOD)活性的 实验（详见实施例七）。
[0015] 发明作用与效果
[0016] 本发明通过实验证明了氯化血红素（Hemin)能够抑制脓毒症小鼠体内促炎因子 分泌，下调肌肉组织Ε3泛素连接酶Atrogin-I和MuRFl的表达水平，以及降低机体内的氧 化应激水平，从而减轻肌纤维蛋白的降解程度，缓解肌萎缩的发展，可作为预防或治疗脓毒 症肌萎缩药物的有效成分。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明中的表观观察各组实验小鼠后肢肌萎缩程度的示意图；
[0018] 图2是本发明的各组实验小鼠术后比目鱼肌湿重的动态变化过程图；
[0019] 图3是本发明的各组实验小鼠比目鱼肌酪氨酸浓度的结果示意图；
[0020] 图4是本发明中在光学显微镜下观察到的经HE染色的各组实验小鼠胫骨前肌肌 纤维横截面的结构示意图；
[0021] 图5是本发明的各组实验小鼠胫骨前肌肌纤维横截面的比较图；
[0022] 图6是本发明中的各组实验小鼠的外周血促炎因子IL-6和TNF- α浓度比较图；
[0023] 图7是本发明的小鼠胫骨前肌中Atrogin-I和MuRFl的Western-Blot检测结果 示意图；
[0024] 图8是本发明的各组实验小鼠胫骨前肌中MDA的浓度结果示意图以及SOD的活性 结果示意图。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合附图来说明本发明的【具体实施方式】。
[0026] 1、实施例中所采用的实验小鼠由解放军第二军医大学实验动物中心提供，所有的 实验小鼠均选用C57BL/6雄性、周龄为8周龄±1周、体重为25g±3g的健康小鼠。
[0027] 2、实施例中所采用的试剂来源如下：
[0028] 氯化血红素（Hemin)购自美国Sigma公司；七氟烧购自上海恒瑞医药有限公司； 二甲基亚砜购自北京华夏远洋科技有限公司；苏木精和伊红染液购自北京博润莱特科技有 限公司；KHB缓冲液购自中科迈晨（北京）科技有限公司；小鼠 IL-6ELISA试剂盒以及小 鼠 TNF- a ELISA试剂盒均购自美国eBioscience公司；抗小鼠 Atrogin-I抗体以及抗小鼠 MuRFl抗体均购自美国Abcam公司；羊抗兔二抗以及beta-actin均购自美国CST公司；MDA 和SOD检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；4%多聚甲醛在实验室按常规配方配制。
[0029] 3、实施例中所用的主要器械来源如下：
[0030] 表1主要器械来源
[0031]
[0032] 4、实施例中脓毒症动物模型的建立方法
[0033] 本实施例使用盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP)小鼠作为脓毒 症动物模型。建模流程如下：步骤I，C57BL/6小鼠禁食12h后七氟烷吸入麻醉，固定于操作 台；步骤2,剪刀备皮，用安尔碘消毒小鼠腹部皮肤，而后沿小鼠腹部中线剪开皮肤约lcm， 沿腹白线剪开腹膜，暴露腹腔内肠管；步骤3,分离并暴露盲肠，挤出盲肠内空气后在距离 盲端Icm处使用3号慕丝线结扎，结扎的盲肠中部使用24G针头单次穿孔；步骤4,将盲肠 回置于腹腔，丝线逐层缝合腹膜和皮肤。
[0034] 手术过程不使用抗生素。对照组实验小鼠和CLP组实验小鼠的区别在于：步骤3 中，对照组实验小鼠只切开腹膜暴露盲肠，并未行结扎穿孔，其他操作步骤同CLP组实验小 ea 邱U
[0035] 5、实施例中对照组、CLP组以及Hemin组实验小鼠的药物配置和实验分组
[0036] 体重25g± 3g的C57BL/6小鼠，采用完全随机分组方式分为3组，CLP组以及Hemin 组实验小鼠均为盲肠结扎穿孔（CLP)小鼠。对照组实验小鼠，术前每天使用ImL注射器腹 腔注射2 % DMSO溶液200 μ L，连续3天；CLP组实验小鼠，术前每天使用ImL注射器腹腔注 射2 % DMSO溶液200 μ L，连续3天；Hemin组实验小鼠，术前每天使用ImL注射器腹腔注射 Hemin溶液200 μ L，连续3天。
[0037] 氯化血红素（Hemin)溶液的配置方法如下：称取Hemin 20mg，加入至IOmL离心管 中，而后抽取2 %二甲基亚砜（DMSO)溶液4mL加入离心管稀释Hemin，吹打混匀，将Hemin 完全溶解，得到浓度为5mg/mL的Hemin溶液。
[0038] 实施例一、表观观察Hemin对CLP小鼠后肢肌萎缩程度的影响
[0039] 通过观察小鼠后肢萎缩程度，从表观确定Hemin是否能够缓解脓毒症引起的小鼠 下肢肌肉的体积缩小。在各组小鼠后左/右爪大小基本一致前提下，其后肢体积减少程度 可反映肌肉的萎缩程度。
[0040] 实验方法
[0041] 步骤1，术后3d，每个实验组随机取6只小鼠，使实验小鼠吸入七氟烷对小鼠进行 麻醉，将小鼠以仰卧姿势置于操作台；
[0042] 步骤2,用碘伏消毒小鼠的后左肢和后右肢，沿小鼠后肢内侧由远端向近端剪开皮 肤，用分离钳将后肢皮肤完全钝性剥脱，暴露肌肉组织；
[0043] 步骤3,在股骨中断离小鼠后肢，生理盐水冲洗表面残留杂质，对比观察各组小鼠 后肢肌萎缩程度。
[0044] 图1为本实施例中各