一种共担载阿霉素和trail的白蛋白纳米粒靶向制剂及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种载药制剂及制备方法，特别是涉及一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂及制备方法。
【背景技术】
[0002]据世界卫生组织发布的《全球癌症报告2014》预测，全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，至2035年人数将增加到2400万人。新增病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国每年新增癌症患者307万，死亡220万，分别占全球总量的21.9%和26.8%。因此，抗肿瘤药物的市场近年增长迅速，全球2008年到2013年的复合增长率7.2%，在中国这一复合增长率达到20.4%，远高于全球增长水平。
[0003]当前治疗的缺陷，化疗是癌症治疗的有效手段，一般的化疗药物有极高的生物毒性而缺乏生物选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，亦杀伤正常组织细胞。由于非特异毒性、缺乏肿瘤选择性以及肿瘤的多药耐药性，对肿瘤的治疗不能达到令人满意的效果，甚至可能造成病人无法耐受而被迫停药。因此如何利用载体输送手段提高药物的肿瘤靶向特异性，提高肿瘤组织对化疗药物的敏感性以及降低系统毒性成为研究的热点。
[0004]美国生命科学公司(American B1science)开发的革El向化疗药物-无溶剂型紫杉醇白蛋白纳米粒Abraxane?的问世激发了人们对白蛋白纳米粒作为抗肿瘤药物载体的研究热情。白蛋白具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等特点，其独特的靶向性和缓释特性，使其在抗肿瘤药物载体方面具有广阔的应用前景。然而这种靶向作用相对较弱，且其耐药肿瘤细胞疗效较差，限制了其应用。为了进一步提高药物的靶向治疗作用，研究者在白蛋白外层偶联或吸附肿瘤特异性亲和配体使其具有主动靶向性。叶酸是叶酸受体的天然配体，而后者在多数恶性肿瘤中的表达明显高于正常细胞。
[0005]因此，本发明以叶酸介导白蛋白纳米粒的肿瘤主动靶向，可以显著提高制剂在肿瘤部位的富集。
[0006]近年来，纳米载体共载化疗药物与基因药物的研究屡见报道，特别是在多药耐药(multidurg-resistance, MDR)肿瘤研究领域。共载基因与化疗药物联合治疗癌症，相对传统化疗，该方法可以减少化疗药物的使用剂量，增加药物在靶器官的分布量，以达到减轻毒副作用及提高疗效的目的。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子(TNF)家族成员之一，能选择性的诱导肿瘤细胞、转化细胞凋亡，而对正常组织无毒性，有望成为肿瘤治疗的新方法，备受人们的关注。TRAIL单独使用较易发生耐药，其与化疗药物(如依托泊苷、顺铂、阿霉素和5-氟尿嘧啶)联合均可见协同或累加效应，能导致细胞凋亡。
[0007]本发明涉及的白蛋白纳米粒的另一个特点是具有肿瘤pH敏感释药特性，而且是逐级释放所装载的阿霉素和TRAIL，这主要是得益于层层自组装(Layer-By-Layer SelfAssembly)制备技术的优势。首先制备载阿霉素的白蛋白纳米粒，然后在白蛋白表面首先吸附一层聚乙烯亚胺PEI (带正电荷)，接着加入协同抗癌剂TRAIL，最后在外层再吸附一层羧甲基壳聚糖-叶酸复合物CMCS-FA (带负电荷)。该设计的优势是除了叶酸可以起到肿瘤靶向作用增加纳米粒子在肿瘤富集外，外层的羧甲基壳聚糖还可以掩蔽PEI的正电荷，降低载体的毒性，而且在肿瘤细胞外的PH条件下羧甲基壳聚糖层恰好可以脱落，首先释放出TRAIL被肿瘤细胞外层的受体识别后，引起肿瘤细胞凋亡，而暴露出的PEI使纳米粒产生电荷翻转，由负变正，提高了与细胞的亲和力，促进载体的细胞内吞。此外，PEI在细胞内溶酶体捕获质子，引起溶酶体破裂，释放出阿霉素，进一步杀伤肿瘤细胞，因此产生协同抗癌作用。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂及制备方法，该白蛋白纳米粒制剂具有叶酸介导的主动革巴向和肿瘤pH敏感释药的特点，该制备方法具有简单易行，可层层组装包载药物，使活性药物在肿瘤部位逐级释放，产生协同抗癌作用的特点。
[0009]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，该制剂由盐酸阿霉素DOX.Η(:1、人肿瘤坏死因子细胞凋亡配体TRAIL、牛血清白蛋白BSA、聚乙烯亚胺ΡΕΙ、羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物CMCS-FA以及注射用水、交联剂等制成的包载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向给药系统；其中，所述白蛋白溶液浓度为1.0-5.0% (克/毫升)，阿霉素浓度
0.001%-0.1% (克/毫升)，白蛋白溶液pH值4.0-9.0 ,TRAIL和DOX的质量比为10:1-1:10，PEI和CMCS的质量比为1:2-1:6。
[0010]所述的共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，其使用的聚乙烯亚胺为线性或分枝状结构，分子量在2 -25 kDa。
[0011]所述的共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，其使用的羧甲基壳聚糖的粘均分子量在20~100 kDa，脱乙酰度在80%~90%，羧甲基取代度在60%~80%。
[0012]所述的共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂，其使用的交联剂为戊二醛。
[0013]一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，所述方法包括以下制备步骤:
(O制备载阿霉素的白蛋白纳米粒
采用去溶剂交联法制备阿霉素白蛋白纳米粒，取BSA适量配制水溶液，用I摩尔每升的氢氧化钠溶液调节PH至8.0。取BSA溶液I毫升，搅拌下向其滴加盐酸阿霉素乙醇溶液4毫升，加入速度10毫升/分。然后，在搅拌下向上述溶液滴加4%的戊二醛乙醇溶液，继续搅拌2小时后，转移到旋转蒸发器内，在40°C真空条件下旋转蒸发20分钟以除去乙醇；得到的产物经10 0C,14000转/分钟条件下离心10分钟，除去离心上清液，再用蒸馏水重复洗涤离心两次，弃去上清液得到纳米粒；然后向纳米粒中添加适量蒸馏水，涡旋分散，得到载阿霉素的白蛋白纳米粒；
(2)羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物(CMCS-FA)的合成:
取0.2克叶酸(FA)溶于10毫升二甲基亚砜中，向其中加入0.1克的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS )和0.2 g的N，N’ - 二环己基碳二亚胺(DCC)(FA/NHS/DCC摩尔比为1:2:2 )，室温活化反应12小时，直到叶酸全部溶解；向上述溶液中加入1%的羧甲基壳聚糖(CMCS)的磷酸盐缓冲液和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC (CMCS/FA/EDC摩尔比为1:1:1)，继续室温避光搅拌16小时；然后向溶液中滴加氢氧化钠调节pH至9.0，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，然后用水透析24小时后，冻干处理；
(3)制备共包载阿霉素和TRAIL的叶酸靶向白蛋白纳米粒:
利用层层自组装技术制备共担载阿霉素和TRAIL的纳米粒；取载阿霉素的白蛋白纳米粒溶液I毫升，向其中加入0.25% PEI水溶液0.1毫升使纳米粒表面电荷由负变正，搅拌混匀后加入10微克/毫升的TRAIL溶液，搅拌均匀后再加入1.5毫克/毫升的CMCS-FA溶液(pH8.0磷酸盐缓冲液配制)使纳米粒电荷由正变负，室温搅拌30分钟，即得。
[0014]所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，步骤(I)中所述BSA溶液浓度为1.0-5.0% (克/毫升)，优选为1.0-2.0%。
[0015]所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，步骤(I)中所述阿霉素浓度0.001%-0.1% (克/毫升)，优选为0.01-0.05%。
[0016]所述的一种共担载阿霉素和TRAIL的白蛋白纳米粒靶向制剂的制备方法，