用于抵消因子Xa抑制的组合物和方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求于2013年1月31日提交的美国临时申请号61/759, 332的利益，所述 美国临时申请的内容整体援引加入本文。
技术领域
[0003] 根据37CFR § 1. 821，以计算机可读形式（CRF)经由EFS-Web作为文件名 PC072006_SEQLIST_ST25. txt同时提交的序列表援引加入本文。序列表的电子拷贝于2013 年12月18日创建，具有7千字节的文件大小。
【背景技术】
[0004] 药理学抗凝是患有血栓前状况的患者的治疗主体。过去五十年，唯一可用的经口 抗凝血药是华法林，维生素 K环氧化物还原酶（VKOR)的抑制剂，其再利用氧化的维生素 K。 华法林具有许多缺点，包括无法预测的药物代谢动力学，其需要频繁监控凝血参数和剂量 调整。然而，在紧急出血或需要急诊手术的情况下，存在允许快速和完全逆转的解毒药。
[0005] 经口直接FXa抑制剂是新出现的抗凝血药，当与标准治疗例如华法林相比较时， 其具有简化患有血栓前疾病的给药方案和止血监控的潜力。尽管这些药物具有许多超过华 法林的优点，但这些新型抗凝血药没有完全有效的逆转试剂。
[0006] 然而，由于害怕难控制的出血，对其效应的特异性对抗措施的缺乏是关键的未满 足的临床需要，其可以限制这些试剂的广泛采用。
【发明内容】
[0007] 通过提供用于抵消直接活化因子X(FXa)抑制剂的效应的组合物和方法，申请人 已解决该关键的未满足的临床需要。
[0008] 根据一些实施方案，本公开提供了通过施用包含因子Xa变体的组合物，用于降低 或预防用直接因子Xa (FXa)抑制剂治疗的对象中的出血的方法，所述因子Xa变体含有至少 一种修饰，包括在位置16处（使用胰凝乳蛋白酶编号系统）使用Thr、Leu、Phe、Asp或Gly 取代野生型氨基酸，或者在位置17处（使用胰凝乳蛋白酶编号系统）使用Leu、Ala或Gly 取代野生型氨基酸。在某些实施方案中，用包含FXa变体的组合物治疗导致出血降低至少 50%。根据某些实施方案，直接因子Xa抑制剂包括利伐沙班或阿哌沙班。在一些实施方案 中，直接FXa抑制剂的血浆浓度通常为治疗量或超治疗量。例如，在一些实施方案中，利伐 沙班的血浆浓度可以是约500nM或更高，并且阿哌沙班的血浆浓度可以是约250nM或更高。 根据某些实施方案，FXa变体含有取代I16L。在一些实施方案中，在比因子Xa抑制剂的血 浆浓度低至少100倍的血浆浓度下，FXa变体能够抵消直接因子Xa抑制剂的效应。在一些 实施方案中，包含FXa变体的组合物在计划的手术前、在损伤后、或者在用直接FXa抑制剂 的有意或意外药物过量后施用。在一些实施方案中，在用FXa变体的第一个剂量后，使用止 血测定监控对象中的止血，并且如果通过预定时间未获得足够的止血，则施用FXa变体的 至少一次第二个剂量，以实现充分止血。根据一些实施方案，预定时间是施用FXa变体的第 一个剂量后约15分钟、30分钟、45分钟或60分钟。其他时间也是可能的。在一些其他实 施方案中，除FXa变体之外还施用至少第二种促凝血剂，包括例如不同的FXa变体、因子IX、 因子XIa、因子Xlla、因子VIII、因子Vila、FEIBA或凝血酶原复合物浓缩剂（PCC)。
[0009] 根据一些实施方案，本公开提供了通过施用包含因子Xa变体的组合物，用于增加 用直接因子Xa(FXa)抑制剂治疗的对象中，响应外源或固有凝血途径的活化而产生的凝血 酶量的方法，所述因子Xa变体含有至少一种修饰，包括在位置16处（使用胰凝乳蛋白酶编 号系统）使用Thr、Leu、Phe、Asp或Gly取代野生型氨基酸，或者在位置17处（使用胰凝 乳蛋白酶编号系统）使用Leu、Ala或Gly取代野生型氨基酸。根据某些实施方案，直接因 子Xa抑制剂包括利伐沙班或阿哌沙班。在一些实施方案中，直接FXa抑制剂的血浆浓度 通常为治疗量或超治疗量。例如，在一些实施方案中，利伐沙班的血浆浓度可以是约500nM 或更高，并且阿哌沙班的血浆浓度可以是约250nM或更高。根据某些实施方案，FXa变体含 有取代I16L。根据某些实施方案，所产生的凝血酶量增加约5%、10%、15%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更多。在一些实施方案中，FXa 变 体能够在比因子Xa抑制剂的血浆浓度低至少100倍的血浆浓度下抵消直接因子Xa抑制剂 的效应。在一些实施方案中，包含FXa变体的组合物在计划的手术前、在损伤后、或者在用 直接FXa抑制剂的有意或意外药物过量后施用。在一些实施方案中，在用FXa变体的第一 个剂量后，使用止血测定监控对象中的止血，并且如果通过预定时间未获得足够的止血，则 施用FXa变体的至少一次第二个剂量，以实现充分止血。根据一些实施方案，预定时间是施 用FXa变体的第一个剂量后约15分钟、30分钟、45分钟或60分钟。其他时间也是可能的。 在一些其他实施方案中，除FXa变体之外还施用至少第二种促凝血剂，包括例如不同的FXa 变体、因子IX、因子XIa、因子Xlla、因子VIII、因子Vila、FEIBA或凝血酶原复合物浓缩剂 (PCC) 〇
[0010] 根据一些实施方案，本公开提供了通过施用包含因子Xa变体的组合物，用于减少 用直接因子Xa (FXa)抑制剂治疗的对象中的凝血时间（如例如使用PT或INR、或一些其他 测定测量的）的方法，所述因子Xa变体含有至少一种修饰，包括在位置16处（使用胰凝乳 蛋白酶编号系统）使用Thr、Leu、Phe、Asp或Gly取代野生型氨基酸，或者在位置17处（使 用胰凝乳蛋白酶编号系统）使用Leu、Ala或Gly取代野生型氨基酸。根据某些实施方案， 直接因子Xa抑制剂包括利伐沙班或阿哌沙班。在一些实施方案中，直接FXa抑制剂的血浆 浓度通常为治疗量或超治疗量。例如，在一些实施方案中，利伐沙班的血浆浓度可以是约 500nM或更高，并且阿哌沙班的血浆浓度可以是约250nM或更高。根据某些实施方案，FXa变 体含有取代I16L。根据某些实施方案，凝血时间减少约5%、10%、15%、20%、30%、40%、 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或更多。在一些实施方案中，FXa变体能够在比因子Xa抑制剂 的血浆浓度低至少100倍的血浆浓度下抵消直接因子Xa抑制剂的效应。在一些实施方案 中，包含FXa变体的组合物在计划的手术前、在损伤后、或者在用直接FXa抑制剂的有意或 意外药物过量后施用。在一些实施方案中，在用FXa变体的第一个剂量后，使用止血测定监 控对象中的止血，并且如果通过预定时间未获得足够的止血，则施用FXa变体的至少一次 第二个剂量，以实现充分止血。根据一些实施方案，预定时间是施用FXa变体的第一个剂量 后约15分钟、30分钟、45分钟或60分钟。其他时间也是可能的。在一些其他实施方案中， 除FXa变体之外还施用至少第二种促凝血剂，包括例如不同的FXa变体、因子IX、因子XIa、 因子Xlla、因子VIII、因子Vila、FEIBA或凝血酶原复合物浓缩剂（PCC)。
【附图说明】
[0011] 图IA-B显示了利伐沙班对游离Wt-FXa或FXa116M^抑制。A) Wt-FXa (2nM)或B) FXaI16\6nM)对肽基底物（SpecXa ;200uM)水解的初速度在增加浓度的利伐沙班下进行测 定。Ki值在每个图上给出。
[0012] 图2A-B显示了在凝血酶原酶中装配的Wt-FXa或FXaIia的利伐沙班抑制。 在 PCPS (20uM)和 FVa (40nM)的存在下，A) Wt-FXa (2nM)或 B) FXaI16L ^nM)对肽基底物 (SpecXa ;200uM)水解的初速度在增加浓度的利伐沙班下进行测定。
[0013] 图3显示了不同浓度的FXa11f^t逆转利伐沙班的凝血酶生成效应的作用。
[0014] 图4A-D显示了 FXa116^逆转利伐沙班的效应的作用。在增加浓度的FXa 116啲存 在和不存在下，正常人血浆与500nM利伐沙班一起温育。在数据分析后，标绘生成的峰凝血 酶（A和C)和总凝血酶（ETP ;B和D)。
[0015] 图5A-B显示了 FXa116^I转高剂量利伐沙班的效应。在增加浓度的FXa 116他存在 和不存在下，正常人血浆与7. 5uM利伐沙班一起温育。在数据分析后，标绘生成的峰凝血酶 (A)和总凝血酶（ETP ;B)。
[0016] 图6A-B显示了 FXaI16L或FXaI16T逆转250nM阿哌沙班的效应。在增加浓度的FXaI16L 或FXaI16T的存在和不存在下，正常人血浆与250nM阿哌沙班一起温育。在数据分析后，标绘 生成的峰凝血酶（A)和总凝血酶（ETP ;B)。
[0017] 图7A-B显示了 FXa116^tFXaI16T逆转高剂量阿哌沙班的效应。在增加浓度的FXallf^ 或FXa I16T的存在和不存在下，正常人血浆与2. OuM阿哌沙班一起温育。在数据分析后，标绘 生成的峰凝血酶（A)和总凝血酶（ETP ;B)。
[0018] 图8A-B显示了 FXaI16^$正在利伐沙班的存在下的全血凝固。全血血栓弹力图用 于评价FXallf^逆转典型㈧和高⑶剂量利伐沙班效应的能力。
[0019] 图9A-B显示了 FXa116^正在阿哌沙班的存在下的全血凝固。全血血栓弹力图用 于评价FXallf^逆转典型㈧和高⑶剂量阿哌沙班效应的能力。
[0020] 图10A-B显示了 FXa116%^凝血酶生成测定中抵消利伐沙班。图IOA显示了利伐沙 班的剂量应答，并且图IOB显示了在利伐沙班的存在下，FXa 1161的剂量应答。
[0021] 图11显示了 FXa116^E小鼠尾部修剪出血模型中抵消利伐沙班。
[0022] 图12证实了施用于小鼠的利伐沙班延迟使用ROTEM测量的全血的凝固时间，并且 用FXa llf^的施用剂量应答性抵消利伐沙班的效应。
[0023] 图13显示了施用于小鼠的利伐沙班阻止在通过激光引起的提睾肌中的血管损伤 部位处的血块形成，并且FXa lia的施用抵消利伐沙班的效应。使用活体显微镜检查以及针 对纤维蛋白和血小板的荧光标记的抗体，显现血块形成。图13A显示了在未经处理的小鼠 中的血块形成。图13B显示了利伐沙班延迟且降低血小板累积且阻止纤维蛋白沉积。相比 之下，图13C显示了在施用利伐沙班和FXa 116M^小鼠中，在损伤部位处发生血块形成。
[0024] 图14是野生型人因子X前蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)。信号肽对应于氨基 酸1-23。前肽对应于氨基酸24-40。活化因子X(FXa)的成熟轻链对应于氨基酸41-179。 活化FXa的成熟重链（在活化肽去除后）对应于氨基酸235-488。活化肽（AP)对应于氨基 酸 183-234。
[0025] 图15是编码野生型人因子X前蛋白的cDNA的核苷酸序列（SEQ ID NO: 2)。编码 序列对应于核苷酸58-1524。
【具体实施方式】
[0026] 本公开提供了用于抵消有此需要的对象中的直接FXa抑制剂的抗凝效应的组合 物和方法。申请人已发现某些FXa变体以剂量依赖性方式快速且完全抵消直接FXa抑制剂 的效应。更具体而言，申请人已发现在以治疗浓度且甚至是超治疗浓度的FXa抑制剂的存 在下，相对少量的FXa变体在体内恢复正常凝血活性。通过提供快速和有效的直接FXa抑 制剂的抗凝效应的解毒药，申请人的公开因此促成实现这些有利的抗凝血药的承诺。
[0027] 凝血因子X(FX)是酶原，其在通过固有因子IX/因子VIII或外源途径（组织因子 /因子Vila)活化后，变成FXa，其为凝血酶原酶的蛋白酶部分。在Arg-Ile易断裂键的蛋白 酶解切割后，释放活化肽（AP)，酶原中一系列充分确定的结构变化驱动至成熟活性丝氨酸 蛋白酶的活化过程（参见 Toso 等人，（2008) J. Biol. Chem. 283,18627-18635 ;Bunce 等人， (2011)Blood 117,290-298 ;和 Ivanciu 等人，（2011)Nat. Biotechnol. 29,1028-1033,整体 援引加入本文）。成熟FXa具有轻链和含有催化结构域的重链。成熟FXa在凝血酶原酶复 合物形成（其包括活化辅因子，因子Va(FVa)的结合）后变成活性丝氨酸蛋白酶。
[0028] 已开发了多种形式的FX，其在活化切割后获得酶原样FXa变体。即，一旦被切割， 所得到的FXa变体就具有弱活性位点功能，并且对通过循环抑制剂（即抗凝血酶III和 TFPI)的失活更有抵抗力。FXa变体因此在血浆中具有比野生型FXa更长的半衰期。FXa变 体结合FVa、脂质膜和钙，以形成完全活性的凝血酶原酶复合物，其有效活化凝血酶原。
[0029] 酶原样FXa变体以酶原样构象循环，并且看起来不是血栓形成的（参见Toso等 人，（2008) J. Biol. Chem. 283,18627-18635 和 Ivanciu 等人，（2011)Nat. Biotechnol. 29， 1028-1033,整体援引加入本文）。此类FXa变体的例子在国际专利公开W02007/059513中 得到描述，所述国际专利公开整体援引加入本文。
[0030] 凝血酶是胰蛋白酶样酶，其属于具有胰凝乳蛋白酶样折叠的蛋白酶的Sl肽酶家 族。凝血蛋白酶含有催化结构域，其与彼此及消化的祖先丝氨酸蛋白酶是高度同源的。结 构同源性/相同性如此之大（>70% )，使得凝血酶（包括因子Xa)的催化结构域中的残 基根据胰凝乳蛋白酶原中的相应残基进行编号。（胰凝乳蛋白酶编号系统；参见Bajaj和 Birktoft，Methods Enzymol. 1993;222:96-128,表 2,以及 Bode W，Mayr I，Bauman Y 等人 The refined I.9 A crystal structure of human alpha-thrombin:interaction with D-Phe-Pro-Arg chloromethylketone and significance of the Tyr-Pro-Trp insertion segment. EMBO J 1989 ;8(11) :3467-3475,所述