人源抗菌肽ll-37在制备治疗或预防血栓性疾病药物中的应用
【技术领域】 本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及人源抗菌肽LL-37在制备治疗血栓性疾病的 药物及在制备预防血栓、抗凝血、降血稠类功能性食品中的新医药用途。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平的不断提高，高胆固醇、高血脂症、动脉粥样硬化及其引发的心 脑血管血栓栓塞性疾病的发病率逐年增加。血栓性疾病是由血栓引起的血管腔狭窄与闭 塞，使主要脏器发生缺血和梗塞而引发机能障碍的各种疾病，属于心脑血管疾病。机体的正 常止凝血，主要依赖于完整的血管壁结构和功能、有效的血小板质量和数量、正常的血浆凝 血因子活性。血栓形成的原因，简单地说是随着人年龄的增长，体内纤溶系统功能逐渐降 低，血液中凝血与抗凝血功能失去平衡而出现异常凝血，即血栓。
[0003] 血栓性疾病的发病率、致死率和致残率非常高。它是严重危害人类健康的疾病之 一，也是世界各国医药学家研宄的热点。目前临床上用于血栓预防和治疗的药物主要分为3 类，抗血小板的药物、抗凝血的药物和溶解血栓的药物。从天然来源中寻找新的活性成分， 并进而研制新的药物也是当今攻克临床顽疾的重要途径，本发明揭示了人源抗菌肽LL-37 具有抗血栓作用，以期为寻找新的抗血栓疾病的原料提供科学依据。
[0004] LL-37属于人源抗菌肽，广泛存在于人体骨髓、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、 消化道及生殖器的上皮细胞中。LL-37的前体蛋白是hCAP-18,该前体蛋白包含一个信号肽 区域、一个Cathelin保守区及一个由37氨基酸所组成的抗菌活性区。一旦hCAP-18从激 活的细胞中分泌后，将通过丝氨酸蛋白酶-3或其他蛋白水解酶的作用剪切信号肽，释放出 有活性的LL-37。之所以被称为LL-37,是由于该活性多肽包含37个氨基酸残基，其N末端 的前两个氨基酸残基为亮氨酸（Leucine)。研宄表明，LL-37具有广谱抗微生物的活性，不 仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，同时对许多 临床耐药细菌同样具有作用。它是脊椎动物自然免疫的关键因子，发挥着重要的抗微生物 感染和病原体入侵效应，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁。此外，LL-37还具有许多其 他重要的生物学活性，如对包括中性粒细胞和单核细胞等在内的多种免疫细胞具有化学趋 化作用，诱导肥大细胞脱颗粒和释放组织胺，还能调节巨噬细胞的转录、促进血管新生、愈 合伤口、在癌细胞中的上调表达，调节单核细胞分泌IL-8和IL-I β，调控DCs和巨噬细胞的 分化诱导变异细胞凋亡等。因此，LL-37-直是国际上的研宄热点。以LL-37为原料进行 食品、药品开发则蕴含着巨大的应用前景。
[0005] 本发明研宄的人源抗菌肽LL-37在预防和/或治疗血栓性疾病中的应用，经文献 检索，未见与本发明相同的公开报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供人源抗菌肽LL-37在预防和/或治疗血栓性疾病中的应 用。
[0007] 本发明具体技术方案如下： 人源抗菌肽LL-37及其修饰肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病药物及在制备预防血 栓、抗凝血、降血稠类功能性食品中的应用，所述人源抗菌肽LL-37氨基酸序列如SEQ ID NO : 1所示。
[0008] Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys He Gly Lys Glu Phe Lys Arg He Val Gln Arg He Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser (SEQ ID NO ：1)〇
[0009] 人源抗菌肽LL-37的分子量为4493Da。
[0010] 可采用现有技术领域常规方法对源抗菌肽LL-37进行修饰得到修饰肽。
[0011] 对于蛋白质和肽类药物，在多数情况下，机体内的氨肽酶及羧肽酶很容易从常见 的直链肽的两端进行逐步的切割分解，使直链肽被降解。多肽修饰是改变肽链主链结构和 侧链基团的重要手段，已有大量文献表明经过修饰后的多肽药物可以显著降低免疫原性、 减少毒副作用、增加水溶性、延长体内作用时间、改变其生物分布状况等等，明显改善药物 的疗效。
[0012] 多肽类药物常用修饰方法包括主链末端的修饰、中间残基的修饰、环化、氨基酸替 换、糖基化修饰及PEG修饰等。
[0013] PEG修饰可以通过增加多肽分子的相对分子量和空间位阻，提高其对多肽水解酶 的稳定性，减少肾小球的滤过作用。PEG化原理是将PEG末端羟基转化成高反应活性基团， 与蛋白质的巯基、氨基、羧基或是羟基进行偶联反应，生成PEG-蛋白质偶联物。目前，PEG修 饰蛋白质和多肽主要是氨基修饰（包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、 N端氨基的烷基化修饰）、羧基修饰、巯基修饰等。其中一类是定点修饰，包括N末端修饰和 半胱氨酸残基修饰。N末端修饰通常是通过PEG-醛类修饰剂与一定量的还原剂如氰基硼 氢化钠进行的还原烷化过程；而半胱氨酸残基修饰是利用修饰剂与蛋白质分子的游离巯基 发生反应进行。另一类修饰反应是在蛋白质赖氨酸的ε氨基上进行的修饰，反应是随机修 饰，反应迅速，修饰率高。
[0014] 本发明所述修饰肽是在人源抗菌肽LL-37的N端、C端或中间残基上连接化学基 团、氨基酸、多肽、蛋白质或PEG。优选修饰肽使用PEG与人源抗菌肽LL-37氨基酸序列中的 巯基、氨基、羧基或羟基发生化学偶联。更优选PEG的相对分子量范围为：5kDa-50kDa。
[0015] 上述人源抗菌肽LL-37在制备预防和/或治疗血栓性疾病药物中的应用，所述血 栓性疾病是包括急性冠状动脉综合征、心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞等的一系列 疾病。
[0016] 上述制备预防和/或治疗为目的的治疗血栓性疾病的药物含有人源抗菌肽LL-37 及其修饰肽以及药学上可以接受的载体。药物剂型可为丸剂、散剂、片剂、膏剂、粉剂、针剂、 水剂、颗粒剂、注射剂或胶囊。将人源抗菌肽LL-37作为活性成分与药物学上可接受的载 体作为赋形剂相结合，按照常规方法制成口服给药的内服剂型或非口服给药的注射剂；即 可制备成为治疗冠心病、心绞痛、脑血栓或肺栓塞等疾病的丸剂、散剂、片剂、膏剂、粉剂、针 剂、水剂、颗粒剂、注射剂等各种剂型的药物。
[0017] 上述预防血栓、抗凝血、降血稠类功能性食品含有人源抗菌肽LL-37及其修饰肽 以及食品学上可接受的赋形剂。所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。将人源抗菌 肽LL-37作为活性成分与食品学上可接受的赋形剂相结合，按照常规方法制成粉剂、片剂、 口服液或胶囊等预防性保健食品或食品添加剂。
[0018] 人源抗菌肽LL-37可采用化学合成的方法制备得到，本发明使用的人源抗菌肽 LL-37委托宁波康贝生化有限公司合成得到。
[0019] 本发明所述的人源抗菌肽LL-37的PEG修饰肽可采用常规方法制备。例如， ① 优选平均分子量为5kDa的单甲氧基聚乙二醇（MPEG)用三氯化物（Tresyl Chloride)活化变为所需的修饰剂TMPEG ; ② 用PBS缓冲液将多肽的浓度调整为100ug/ml，然后将调整好浓度的多肽与过量的 活化的聚合物TMPEG在室温条件下（25°C -40°C )，pH 7-9,共价反应2小时（优选温度为 37〇C )； ③ 向反应体系中加入过量的甘氨酸再在同样的温度条件下孵育2小时，以反应除去剩 余的TMPEG ; ④ 反应结束后，将整个反应体系保存在4°C条件下备用； ⑤ 纯化时，先将样品用PBS缓冲液按1:10的条件稀释，然后将整个反应混合物进行凝 胶渗透层析，所选条件为PBS洗脱的Super 〇se-12HR 10/30柱，以每分钟0. 3ml的速度用 PBS洗脱。
[0020] 药理药效实验证实，本发明所述人源抗菌肽LL-37能抑制血小板聚集，显著延长 APTT、PT时间，具有抗血栓形成活性，能够用于制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物；还 可应用于制备预防血栓、抗凝血、降血稠类功能性食品的原料。
[0021] 本发明具有如下优点：
[0023] 人源抗菌肽LL-37作为存在于人体中的抗菌肽，具有有效抗凝血、抗血栓活性较 好等优点。因此，以人源抗菌肽LL-37为主要活性成分可广泛用于预防和/或治疗人类血 栓性疾病，相容性好，生物利用度高，且不易引发抗原抗体反应。
【附图说明】
[0022] 图1表示所述人源抗菌肽LL-37对人血小板聚集的抑制作用。
[0023] 图2表示所述人源抗菌肽LL-37在大鼠动静脉旁路模型实验中的抗血栓形成作 用。
[0024] 图3为人源抗菌肽LL-37的出血风险评估（图3A对出血时间进行考察，图3B对 出血体积进行考察）。
【具体实施方式】
[0025] 下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于 此。
[0026] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理 解的含义。
[0027] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只 是为了举例说明本发明，而非以任何方式限