可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜及其制法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药和生物材料领域，主要涉及新型去细胞瓣膜的技术领域，具体涉及可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜及其制法和应用。
【背景技术】
[0002]心脏瓣膜病是一种严重危害人类健康的世界性公共问题，发病率约2.5%。心脏瓣膜置换是治疗瓣膜病的有效方法，到2050年，需行瓣膜置换手术病人估计将会超过85万。临床上常用的心脏瓣膜替换物多为机械瓣膜与生物瓣膜，但它们均有严重缺陷。机械瓣膜的血流流场紊乱常导致血液有形成分破坏，可能发生与凝血系统有关的出血及血栓形成的并发症，术后需终生服用抗凝药物治疗。生物瓣膜大多为经戊二醛交联的猪心脏瓣膜或牛心包瓣，但因细胞毒性、钙化位点暴露、缺少内皮细胞屏障等，瓣膜组织会发生退行性变、钙化，最终导致瓣膜裂解、衰坏而至功能障碍，使患者约10-15年后面临再次手术的可能，且以上两种瓣膜均无法随患者生长而重构。因此进一步改进或研制一种能够克服上述缺陷的理想瓣膜替代物成为心脏外科医生的追求目标。
[0003]组织工程心脏瓣膜是一种新颖的瓣膜假体，利用组织工程技术将种子细胞种植于支架材料上，并于特定的条件下构建组织工程心脏瓣膜，使之在植入体内替换病变瓣膜后仍然具有生长、重建、修复能力，术后无需抗凝治疗，其生物学性能、机械性能与正常瓣膜相当。支架材料主要有去细胞的生物基质和合成的高分子聚合物。
[0004]去细胞基质由于其良好的生物相容性，并可为种子细胞黏附、增殖、分化等提供类似于体内的基质微环境，在组织工程学中得以广泛应用。目前去细胞基质支架材料多为猪心脏瓣膜和牛心包，但去细胞基质表面无完整的内皮细胞覆盖，不能控制血浆成分的渗入，可能是引起组织钙化和衰败的先行条件。另外，由于去细胞基质表面胶原纤维的暴露，在体内可能激活血小板而导致血栓的形成。最终，手术置换的瓣膜会裂解、衰坏而至功能障碍和产生一系列与血栓相关的并发症，所以去细胞基质的内皮化非常重要。
[0005]血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)具有促进内皮细胞增殖、生长、移行的功能，常用来修饰生物材料，使生物材料功能化。其与细胞膜上特异性受体结合，通过VEGF/VEGFR-2信号通路促进细胞的增殖和材料内皮化、血管形成等。其中VEGF 165在各种细胞中分泌最多，也是VEGF发挥作用的主要形式。血管内皮祖细胞表面高表达VEGFR-2，可与VEGF165特异性结合，利于促进血管内皮祖细胞动员、迀移和在局部的定植、生长、分化。
[0006]纳米载药控释系统可作为一种新颖的药物载体，能够携带多种药物且能够通过改变纳米材料的分子量和投料量严格控制药物的释放速度和释放周期，在局部可达到预定的药物浓度，从而提高药物的生物利用度。纳米载药控释系统以合适的方法将蛋白类药物包封后，既不影响蛋白活性，又能对其有效地保护，使其避免体内蛋白酶的降解而过快清除。
[0007]聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链段以重复乙二醇氧化乙稀为基础结构，具有高度亲水性、无毒、无抗原性和免疫原性及良好组织相容性等优点。聚己内酯(polycaprolactone,PCL)具有优良的药物透过性、优异的生物可降解性和生物相容性。PEG与疏水性PCL链段结合后的PEG-PCL共聚物，与PCL —样，均可作为优良的药物运输骨架材料，在医药、食品等领域得到广泛应用。PCL和PEG均已被美国FDA组织批准在人体内使用，且PEG-PCL经国际认证无毒害，无免疫原性，具有良好的生物降解性和相容性。
【发明内容】
[0008]本发明解决的技术问题是:去细胞基质表面如果没有被内皮细胞完整覆盖，将不能控制血浆成分的渗入，可能会引起瓣膜组织的钙化和激活血小板，但目前去细胞基质的内皮化技术还不成熟，其内皮化速度和效果还有待提高，瓣膜支架材料的相关生物学性能还有待改善。
[0009]本发明的目的在于提供一种可控释放血管内皮生长因子的新型去细胞瓣膜的制备方法。借鉴纳米载药控释系统原理，利用MAL-PEG-PCL共聚物修饰的PCL纳米粒包封生物信号分子VEGF165，形成可控释放的载VEGF165的PCL纳米粒，再通过MAL-PEG末端马来酰亚胺中不饱和的碳碳双键与引入到去细胞瓣胶原蛋白上的巯基发生迈克尔加成反应，从而制备可控释放VEGF165功能的去细胞瓣膜。该纳米载体以合适的方法将VEGF165包封后，既不影响生物信号分子活性，又能对其有效地保护，使其免遭化学和酶降解以及体内高速血流剪切力的破坏，最终保持生物信号分子的生物活性。通过调整PCL的分子量和投料量控制VEGF165的释放速度和释放周期，从而使去细胞瓣处维持一定浓度的VEGF165。
[0010]去细胞瓣膜上的VEGF165对内皮祖细胞具有强烈的招募作用，使内皮祖细胞在去细胞瓣膜局部定植、生长、分化，最终实现去细胞基质支架材料的内皮化，使去细胞基质与血浆成分相隔开，从而防止钙化位点和胶原纤维的暴露，进而防止或延缓瓣膜支架材料的钙化和血小板的激活。将纳米载药控释系统应用于组织工程，制备了可控释放VEGF165的新型去细胞瓣膜，为组织工程心脏瓣膜的改性修饰研宄提供一种新方法。
[0011]具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案:
[0012]本发明提供一种可控释放血管内皮生长因子的纳米材料，其特征在于，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成:马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯，聚己内酯和血管内皮生长因子。
[0013]优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成:马来酰亚胺一聚乙二醇-聚己内酯4-10重量份，聚己内酯20-40重量份，和血管内皮生长因子0.001-0.01 重量份。
[0014]优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成:马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯4-6重量份，聚己内酯20-30重量份，和血管内皮生长因子0.001-0.005 重量份。
[0015]优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成:马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯，聚己内酯，磷脂和血管内皮生长因子。
[0016]优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料采用含有下述组分的原料制成:马来酰亚胺一聚乙二醇-聚己内酯4-10重量份，优选为4-6重量份，聚己内酯20-40重量份，优选为20-30重量份，磷脂5-10重量份，优选为5-8重量份，和血管内皮生长因子0.001-0.01重量份，优选为0.001-0.005重量份。
[0017]优选的，上述纳米材料中，所述血管内皮生长因子包含VEGF165。
[0018]优选的，上述纳米材料中，所述血管内皮生长因子占所述纳米材料的质量分数为0.003 % -0.04 %，优选为 0.03 % -0.02 %。
[0019]优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料中血管内皮生长因子的包封率为75% -85%。
[0020]优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料的平均粒径为80-220nm。
[0021]优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料中血管内皮生长因子在48h的释放率为50-60%。
[0022]优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料通过包含下述步骤的方法制备得到:
[0023]将血管内皮生长因子、聚己内酯和马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯溶于有机溶剂中形成油相，以水溶性聚合物水溶液为水相，超声处理得到所述纳米材料。
[0024]优选的，上述纳米材料中，所述纳米材料通过包含下述步骤的方法制备得到:
[0025](I)将所述血管内皮生长因子和磷脂混合反应得到血管内皮生长因子-磷脂复合物；
[0026](2)将血管内皮生长因子-磷脂复合物、聚己内酯和马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯溶于有机溶剂中形成油相，以水溶性聚合物水溶液为水相，超声处理得到所述纳米材料。
[0027]优选的，上述纳米材料中，所述超声处理后还包括下述步骤:
[0028]将步骤超声处理后所得水包油乳剂中所述有机溶剂挥发，得到所述纳米材料。
[0029]优选的，上述纳米材料中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，优选为二氯甲烷。所述水溶性聚合物选自聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮或乙烯-乙烯醇共聚物，优选为聚乙烯醇。
[0030]优选的，上述纳米材料中，所述血管内皮生长因子和磷脂的重量比为1:1000?1:5000ο
[0031]优选的，上述纳米材料中，所述油相与水相的体积比为1:6?1:8。
[0032]优选的，上述纳米材料中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯采用包含下述组分的原料制成:马来酰亚胺_聚乙二醇1-5重量份，和ε -己内醋0.4-2重量份。
[0033]优选的，上述纳米材料中，马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯采用包含下述组分的原料制成:马来酰亚胺_聚乙二醇1-2重量份，和ε -己内醋0.4-1.5重量份。
[0034]优选的，上述纳米材料中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯的平均分子量为4000-7000 ο
[0035]优选的，上述纳米材料中，所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯通过包括下述步骤的方法制备得到:
[0036](I)将马来酰亚胺-聚乙二醇、ε -己内酯和催化剂混合，在65-70°C温度下发生开环聚合，合成马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯初产物；
[0037](2)将步骤(I)所述初产物溶解于有机溶剂中，加入沉淀剂使其沉淀，得到所述马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯。
[0038]优选的，上述纳米材料中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，优选为二氯甲烷。所述沉淀剂选自乙醚、甲醇、正己烷或环己烷中的一种或两种以上，优选为乙醚或甲醇的一种或两种。
[0039]优选的，上述纳米材料中，所述血管内皮生长因子-磷脂复合物通过包括下述步骤的方法制备得到:
[0040]将磷脂加入叔丁醇中，配制成磷脂/叔丁醇溶液，将磷脂/叔丁醇溶液与血管内皮生长因子水溶液混合，在-50?_60°C条件下冷冻，得到所述血管内皮生长因子-磷脂复合物。
[0041]优选的，上述磷脂/叔丁醇溶液的浓度为5-10mg/ml，所述血管内皮生长因子水溶液的浓度为1-10 μ g/ml，优选为1-5 μ g/mlo
[0042]本发明还提供一种可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，其特征在于，包括巯基化的去细胞瓣膜和连接于所述巯基化的去细胞瓣膜上的上述任一种纳米材料。
[0043]优选的，上述可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜，其通过包括下述步骤的方法制备得到:
[0044](I)去细胞瓣膜和巯基化试剂N-丁二酸-S-乙酰基巯基乙二醇酯发生巯基化反应后，用盐酸羟胺对所生成的乙酰化巯基进行保护，得到巯基化的去细胞瓣膜；
[0045](2)将步骤(I)所述巯基化的去细胞瓣膜与上述任一纳米材料混合，反应后得到所述可控释放血管内皮生长因子的去细胞瓣膜。
[0046]本发明还提供上述任一种纳米材料的制备方法，包括下述步骤:
[0047]将血管内皮生长因子、聚己内酯和马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯溶于有机溶剂中形成油相，以水溶性聚合物水溶液为水相，超声处理得到所述纳米材料。
[0048]优选的，上述制备方法中，包括下述步骤:
[0049](I)将所述血管内皮生长因子和磷脂混合反应得到血管内皮生长因子-磷脂复合物；
[0050](2)将血管内皮生长因子-磷脂复合物、聚己内酯和马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯溶于有机溶剂中形成油相，以水溶性聚合物水溶液为水相，超声处理得到所述纳米材料。
[0051]优选的，上述制备方法中，还包括下述步骤:
[0052]将超声处理后所得水包油乳剂中所述有机溶剂挥发，得到所述纳米材料。
[0053]优选的，上述制备方法中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，优选为二氯甲烷。所述水溶性聚合物选自聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素，优选为聚乙烯醇。
[0054]优选的，上述制备方法中，还包括下述步骤:
[0055]加入聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)破坏未包封的血管内皮生长因子-磷脂复合物。
[0056]优选的，上述制备方法其中，所述血管内皮生长因子和磷脂的重量比为1:1000?1:5000ο
[0057]优选的，上述制备方法中，所述油相与水相的体积比为