一种应用酶制剂提取葛根总黄酮的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于酶制剂的应用领域，尤其是一种用酶制剂提取葛根总黄酮的方法。
【背景技术】
[0002]葛根(Radixpuerariae)为豆科植物野葛 Pueraria lobata (W1lld) Ohwi 的干燥根，其味甘、辛、性平。葛根是我国一种传统中药，对于葛根的药用价值早在《神农本草经》中就有记载，其主要成分是淀粉，此外还含有约12%的黄酮类化合物，包括大豆(黄豆)甙、大豆甙元、葛根素等10余种；并含有胡萝卜甙、氨基酸、香豆素类等。葛根目前己被卫生部认定为药食两用的山地植物。
[0003]葛根具有解痉退热、生津、透疹、升阳止泻等功能。同其它大多数黄酮类化合物相似，葛根黄酮类化合物也具有多种药理功能，如改善血液循环、降血压、降血糖、降血脂、抑制动脉硬化、抗心率失常、抗血小板聚集、抗肿瘤、抗缺氧与抗氧化等。现在葛根总黄酮因其显著的药用价值己被广泛应用于医药工业、食品工业、日用化工等领域。
[0004]近年来，天然植物有效成份因其功效明显、天然低毒等特点倍受青睐，引发了全世界范围使用天然草本植物来预防和治疗各种疾病的热潮。随着对天然植物药材研究的深入开展，葛根的研究范围有了进一步拓展，其中葛根的黄酮提取研究受到了广泛关注，目前葛根总黄酮的提取的主要方法有:(1)醇回流法，主要以水、乙醇、碱性醇、石灰水、甲醇、丙酮等作为溶媒，加热回流。回流提取2?3次，提取葛根总黄酮；(2)醇渗漉法；(3)浸溃法；
[4]微波辅助萃取法；(5)酶解回流法；(6)超声逆流萃取法；(7)离子配位萃取法。
[0005]酶工程技术是近几年来用于重要工业的一项生物工程技术。通过酶反应温和地将植物组织分解，加速有效成分的释放提取，选用相应的酶可将影响液体制剂澄清度的杂质如淀粉、蛋白质、果胶等分解去除，并且针对根中含有脂溶性成分多，通过葡萄糖苷酶或转糖苷酶，使脂溶性成分转化成水溶性糖苷类，酶反应提取温度低，可破坏植物细胞壁，促进有效成分提取；改变提取的目的成分的性质，加强药物活性；去除体系内杂质，提高提取体系澄清度、改变药材质地。
[0006]市场对葛根黄酮的需求越来越大。但由于科技投入的不足，国内的葛根黄酮制取技术相对落后，且葛根黄酮的提取方法多为有机溶剂提取，生产效率低、能耗大、环境污染严重、杂质含量高，产品缺乏市场竞争力。将酶法应用到葛根黄酮的提取中，该方法能在温和的条件下对植物有效成分进行高选择性转化，不仅可以克服工业中常用的醇水提取方法中有效成分提取率低、工序复杂等问题，提高提取体系澄清度、改变药材质地，还可以在提取中改变原有天然成分的结构，增加提取物的生理活性，具有潜在的工业应用价值。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有提取方法中有效成分提取率低、工序复杂等问题，提供一种应用酶制剂提取葛根总黄酮的方法。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案实现的: (1)将干燥的葛根粉碎，过筛，取葛根粉加入蒸馏水溶解；
(2)调节pH至4.0-6.0，加入一定量的酶制剂，在40-60°C的温度下酶解1_3小时；
(3)高温灭酶；
(4)离心，上清液备用，沉淀再加入等量的蒸馏水60°C热浸10h，反复2次。
[0009](5)合并上清液和滤液，减压浓缩为葛根总黄酮浸膏。
[0010](6)得到的葛根黄酮浸膏水溶解液经HPD-600大孔树脂进行吸附、洗脱。洗脱时先用蒸馏水洗去糖类、蛋白质、鞣质等水溶性杂质，然后改用60%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并回收乙醇，将浓缩液干燥得到纯度大于95%的葛根黄酮。
[0011]所述步骤(I)中葛根粉碎至40-100目，葛根与加入的蒸馏水的料液比为1:10-30。
[0012]步骤(2)酶制剂的重量份组成为:纤维素酶1-5份、木聚糖酶1-5份、蛋白酶1-5份、淀粉酶1-5份。其中蛋白酶选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的至少一种。淀粉酶选用中温α-淀粉酶和β-淀粉酶中的至少一种。酶制剂添加量为葛根粉添加量的0.1-1%
步骤(3)中所述的灭酶温度为80-100°C，时间5-10min。
[0013]步骤(6)中所述的HPD-600大孔树脂的条件为:径高比为1:6，上样浓度50mg/mL，最大上样量为3BV，流速为lmL/min，洗脱剂用量5BV。
[0014]本发明的优点和积极效果是:
本发明应用酶制剂提取葛根总黄酮，反应条件温和，能保持天然产物的构象，不破坏其立体结构和生物活性，有利于保持有效成分原有的药效；能够去除体系内杂质，提高提取液的澄清度，提高了葛根有效成分的提取率。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0016]本发明的具体实例:
实施例1
(1)取干燥的葛根粉碎至80目，取该粉末10g，加入蒸馏水10mL溶解；
(2)取酶制剂:纤维素酶0.0037g,木聚糖酶0.0056g,木瓜蛋白酶0.0018g,中温α -淀粉酶0.0037g加入葛根溶液中，调节pH至4.0，在40°C条件下酶解I小时；
(3)80°C灭酶 1min ；
(4)离心，沉淀加入10mL蒸馏水，60°C加热提取10小时，过滤，反复提取2次；
(5)合并上清液和滤液，减压浓缩为葛根总黄酮浸膏。采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为7.32% ；
(6)得到的葛根黄酮浸膏水溶解液经HPD-600大孔树脂进行吸附、洗脱。HPD-600大孔树脂的条件为:径高比为1:6，上样浓度50mg/mL，最大上样量为3BV，流速为lmL/min，洗脱剂用量5BV。洗脱时先用蒸馏水洗去糖类、蛋白质、鞣质等水溶性杂质，然后改用60%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并回收乙醇，将浓缩液干燥，采用高效液相色谱法测定得到葛根黄酮纯度大于95%。
[0017]实施例2 (1)取干燥的葛根粉碎至80目，取该粉末10g，加入蒸馏水150mL溶解；
(2)取酶制剂:纤维素酶0.0062g，木聚糖酶0.0093g，碱性蛋白酶0.0031g，中温α-淀粉酶0.0062g，加入葛根溶液中，调节pH至4.5，在45°C条件下酶解2小时；
(3)85°C灭酶 1min ；
(4)离心，沉淀加入150mL蒸馏水，60°C加热提取10小时，过滤，反复提取2次；
(5)合并上清液和滤液，减压浓缩葛根总黄酮浸膏。采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为7.48% ；
(6)得到的葛根黄酮浸膏水溶解液经HPD-600大孔树脂进行吸附、洗脱。HPD-600大孔树脂的条件为:径高比为1:6，上样浓度50mg/mL，最大上样量为3BV，流速为lmL/min，洗脱剂用量5BV。洗脱时先用蒸馏水洗去糖类、蛋白质、鞣质等水溶性杂质，然后改用60%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并回收乙醇，将浓缩液干燥，采用高效液相色谱法测定得到葛根黄酮纯度大于95%。
[0018]实施例3:
(1)取干燥的葛根粉碎至100目，取该粉末15g，加入蒸馏水400ml溶解；
(2)取酶制剂:纤维素酶0.0125g，木聚糖酶0.0375g,中性蛋白酶0.0325g, β -淀粉酶0.065g加入葛根溶液中，调节pH至5.0，在50°C条件下酶解3小时；
(3)85°C灭酶 1min ；
(4)离心，沉淀加入400mL蒸馏水，60°C加热提取10小时，过滤，反复提取2次；
(5)合并上清液和滤液，减压浓缩为葛根总黄酮浸膏。采用分光光度法测定总黄酮含量，葛根总黄酮提取率为7.80% ；
(6)得到的葛根黄酮浸膏水溶解液经HPD-600大孔树脂进行吸附、洗脱。HPD-600大孔树脂的条件为:径高比为1:6，上样浓度50mg/mL，最大上样量为3BV，流速为lmL/min，洗脱剂用量5BV。洗脱时先用蒸馏水洗去糖类、蛋白质、鞣质等水溶性杂质，然后改用60%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩并回收乙醇，将浓缩液干燥，采用高效液相