针对登革病毒的疫苗组合物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和制药工业领域，特别地涉及针对登革病毒（DV)的疫苗制 剂的获得，所述疫苗制剂基于重组的蛋白质抗原和具有确定序列的寡核苷酸。 现有技术
[0002] 登革热是影响人群体的由最广泛散布的节肢动物所传播的病毒性疾病。每年报 告5千万至1亿个登革热病例，其中500, 000个导致该疾病的更严重的形式，其称为登革出 血热（Guzman等人，Lancet Infect. Dis. ,2002,2:33-42)。该疾病的致病因子为DV，其属 于黄病毒科（Flaviviridae)，黄病毒属（flavivirus)。DV是由四种血清型形成的病毒复 合体。它是一种有包膜病毒，其脂质膜包含其三种结构蛋白中的两种：包膜蛋白和膜蛋白。 该脂蛋白性质的包膜围绕由其结构蛋白中的第三种即衣壳蛋白所构成的二十面体核衣壳 (Leyssen 等人，Clin. Microbiol. Rev.，2000, 13:67-82) 〇
[0003] 在最近几十年中，这些病毒的感染的全球扩张已使得开发有效疫苗成为公众健康 的迫切问题。该目标受到多种因素的限制。首先，被一种血清型感染不诱导针对其余血清 型的长期交叉保护（Leyssen等人，Clin. Microbiol. Rev.，2000, 13:67-82)，并且同时，异 型继发感染对于该疾病的严重形式的发展来说是主要的风险因素（Guzman等人，Lancet Infect. Dis.，2002, 2:33-42 ;Mongkolsapaya 等人，Nat. Med.，2003, 9:921-927)。因此，理 想的针对DV的疫苗应当诱导针对四种病毒血清型（DV1、DV2、DV3和DV4)的长期保护性免 疫。
[0004] 目前处于最先进开发阶段的疫苗候选物经由通过在细胞培养物中连续传代而 减毒的病毒毒株或经由重组方式来建立。这些候选物的根本限制为在四价制剂中四种 血清型之间的病毒干扰，因此使得控制诱导出等价的免疫应答非常复杂，并且必须在它 们之间以长的时间间隔施用疫苗剂量（Bhamarapravati等人，Vaccine, 2000, 18:44-47 ; Kanesa-Thasan 等人，Vaccine，2001，19:3179-3188;Mor;rison 等人，J. Infect. Dis.，2010, 201:370-377)。此外，由于其作为活病毒的性质，不可能在小于1岁的儿童中施 用它们。
[0005] 作为具有吸引力的备选方案，已展开了一系列基于亚单位疫苗的临床前研宄。该 分析研宄具有三个相对于用减毒活病毒进行疫苗接种而言的根本优点：1)其是潜在地安 全的疫苗；2)由于免疫原的非复制性性质，不应当发生病毒干扰现象；和3)可以提出短的 疫苗接种方案，这与在施用减毒活病毒时所发生的相反，后者在疫苗剂量之间需要长的间 隔以取得增强效果。
[0006] 最具有前景的亚单位疫苗候选物之一是由Hawaii Biotech/Merck公司所开 发的那种（Hombach, Rev. Panam. Salud Publica.，2007, 21:254-260)。它是由在昆虫 细胞中表达的病毒包膜的四种蛋白形成的候选物。已经在小鼠和猴子中评价了单价 和四价制剂，其中具有与用减毒活病毒所获得的相当的免疫原性结果（Clements等 人，Vaccine，2010, 28:2705-2715)。然而，在单价制剂的情况下，需要强有力的尚未被批 准用于在人中使用的佐剂，以取得适当的免疫应答。而在非人灵长类中试验的四价制剂， 除了具有在人中尚未被批准的佐剂外，还包含与人内皮细胞具有可能的同源性的DV2的 NSl蛋白，并且可能引起自身免疫现象。另外，不存在关于诱导出细胞介导的免疫应答的数 据，细胞介导的免疫应答是最近鉴定出的具有针对登革热的保护作用的免疫系统分支（Gil 等人，Viral Immunol.，2009, 22:23-30 ;Yauch 等人，J. Tmmunol.，2009, 182:4865-4873 ; Yauch 等人，J. Immunol.，2010, 185:5405-5416)。
[0007] 通过保持与亚单位疫苗相关的优点并同时寻找使用氧化铝作为基础佐剂的更 具免疫原性的制剂，一组古巴研宄者开发出了基于DV的衣壳蛋白和包膜蛋白的结构域 III (DomIII)的工作方针（Guzman 等人，Exp. Rev. Vaccines, 2010, 9:137-147) 〇
[0008] DV的衣壳蛋白经证明在病毒粒子的装配中是必不可少的，并且其主要功能为保护 病毒基因组。其分子量为9至12kDa(112-127个氨基酸），并且其具有明显的碱性特征，因为 其氨基酸的25%是精氨酸和赖氨酸。该蛋白质完全位于病毒粒子的结构的内部，没有任何 暴露的区域（Kuhn等人，Cell, 2002, 108:717-725)，这使得其对于成为疫苗的一部分来说 是极具吸引力的，因为从理论上讲，它不应当是免疫放大性抗体的靶标。另一方面，在其序 列中已描述了数个关于人的CTL表位，这使得能够诱导针对该病毒的有效的细胞免疫应答 (Gagnon 等人，J. Virol.，1996, 70:141-147 ;Gagnon 等人，J. Virol.，1999, 73:3623-3629) 〇
[0009] 虽然存在几项对于该蛋白质的结构特征的研宄，但是直到2007年才首次在小鼠 中评价了 DV的衣壳蛋白的免疫原性。在该研宄中，通过重组方式在大肠杆菌（Escherichia coli)中获得了 DV2的衣壳蛋白。在半纯化过程之后，在小鼠中实施免疫接种方案，并且在 用感染性DV2进行颅内攻击后在小鼠中获得了部分保护，其中没有检测到中和抗体（Lazo 等人，Vaccine, 2007, 25:1064-1070)。然后，以实验室规模开展了所述分子的纯化和体外聚 集过程，并且再重新在小鼠中进行试验以测量保护性免疫应答，以及与其功能性有关的免 疫学机制（Lopez等人，Arch. Virol.，2009, 154:695-698)。免疫原性分析揭示了通过干扰 素 γ (IFN-γ)分泌所测量的细胞免疫应答的诱导，所述干扰素 γ分泌来自接受了所述蛋 白质的聚集形式的小鼠的脾细胞。所述分泌依赖于CD4+和CD8 +细胞。而在用感染性DV2 进行攻击后，在用所述蛋白质的聚集变化形式进行免疫接种的动物中获得了显著的保护， 并且所述保护也依赖于CD4+和CD8 +细胞（Gil等人，Int. Immunol.，2009, 21:1175-1183)。 基于上面所描述的结果，那么提出了在同一个遗传构建体中将DV2的衣壳蛋白与相同病 毒血清型的包膜蛋白的DomIII区域相组合。DomIII已被广泛地描述为牵涉与细胞受体 结合的区域（Chen等人，J. Virol.，1996, 70:8765-8772)，并且另外，已证实了在用包含 所述区域的融合蛋白进行免疫接种的小鼠中诱导了中和性和保护性免疫应答（Crill等 人，J. Virol.，2001，75:7769-7773 ;Hermida 等人，J. Virol. Methods, 2004,115:41-49; Simmons 等人，Am. J. Trop. Med. Hyg.，2001，65:159-161)。而于在非人灵长类中进行的 研宄之中证实了唯有通过使用弗氏佐剂诱导了功能性的保护性免疫应答（Hermida等 人，Vaccine, 2006, 24:3165-3171) 〇
[0010] 病毒的衣壳区域与病毒包膜的DomIII的联合允许在同一个分子中存在两个潜在 保护性的区域，其能够同时诱导中和抗体（DomIII)和细胞免疫应答（衣壳）。如此，获得了 命名为DIIIC-2的遗传构建体（与衣壳蛋白的N-末端区域相融合的DomIII，血清型2)，其 在大肠杆菌中进行表达；并且以实验室规模纯化了所得的蛋白质，并使其经历用具有未知 序列的寡核苷酸的混合物进行聚集的过程。在于小鼠中施用三个剂量后，可以检测到抗病 毒的和中和性的抗体的存在。类似地，可以在经免疫接种的动物的脾细胞中测量到IFN- γ 分泌，其中在接受了聚集变化形式的动物中检测到显著的水平。与细胞免疫应答相一致， 在颅内攻击后获得了显著的保护，并且所述保护依赖于在免疫接种过程期间所诱导的CD4+ 和CD8+细胞（Valdes等人，Virology, 2009, 394:249-258)。这些结果整体地允许选择蛋白 DIIIC-2的聚集形式用于下面的在非人灵长类中的研宄。
[0011] 第一项在非人灵长类中的研宄在事先用DV2进行感染的动物中进行，以认识该蛋 白质的增强能力。正如所预期的那样，通过在病毒感染之后三个月施用蛋白DIIIC-2,动物 发展出了高水平的对于同源病毒的抗病毒中和抗体，这表明在所述重组蛋白中存在功能性 表位（Valdes 等人，Clin. Vaccine Immunol. , 2011, 18:455-459) 〇
[0012] 在本发明之前已经知晓，添加寡核苷酸以形成蛋白DIIIC-2的聚集 变化形式有利于在小鼠中的细胞免疫应答和针对同源病毒的保护（Valdes等 人，Virology，2009, 394:249-258)。然而，不知道所使用的寡核苷酸的序列是否影响所诱导 的免疫应答的质量。
[0013] 根据前面所提及的基础知识，开发能够诱导针对该病原体的四种血清型的安全且 有效的免疫应答的针对DV的疫苗是一个尚未解决的问题。本发明正是旨在该目标。
[0014] 发明描述
[0015] 本发明通过提供疫苗组合物而解决了上面提出的问题，所述疫苗组合物的特征 在于，其包含：a)至少一种包含DV衣壳蛋白序列的至少50 %的抗原，和b)标识为SEQ ID NO. 1的寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物的特征在于，所述包含DV 衣壳蛋白序列的至少50 %的抗原为包含所述蛋白质的氨基酸1至99的重组抗原。在一个实 施方案中，本发明的疫苗组合物包含嵌合抗原，所述嵌合抗原包含衣壳蛋白的氨基酸1至 99和病毒包膜蛋白的DomIII区域的氨基酸286至426。在一个特别的实施方案中，所述重 组抗原选自 SEQ ID NO. 5(抗原 DIIIC-1)、SEQ ID NO. 6(抗原 DIIIC-2)、SEQ ID NO. 7(抗 原 DIIIC-3)和 SEQ ID NO. 8 (抗原 DIIIC-4)。
[0016] 为了证实是否依赖于用于蛋白质聚集的寡核苷酸的类型才诱导了最佳的免 疫应答，选择相应于血清型2的组合物作为模型。为此，在几种在现有技术中所描 述的具有已知序列的寡核苷酸存在下，使蛋白DIIIC-2(包含DV2的病毒包膜蛋白 的DomIII和衣壳蛋白的氨基酸1至99的嵌合抗原）沉淀。已知这些寡核苷酸中的 一些具有辅佐能力（Klinman, Int. Rev. Immunol. 2006, 25:1-20 ；Vollmer, Int. Rev. Immunol.，2006, 25:125-134)。此外，还包括通过所提及的寡核苷酸中的两种的融合而形 成的新的寡核苷酸（Krug 等人，Eur. J. Immunol.，2001，31:2154-2163 ;Verthelyi 等人，J. Immunol.，2001，166:2372-2377)。在小鼠中评价了免疫原性之后，可以证明新的寡核苷酸 (SEQ ID NO. 1)有利于最佳的细胞应答（通过IFN-γ分泌来测量），因此选择其用于在病 毒性脑炎的小鼠模型中测定针对致死性同源病毒攻击的保护能力。作为结果而获得了，通 过存活百分比和通过在脑中病毒血症水平的降低，佐以氧化铝的具有SEQ ID NO. 1所示寡 核