一种鱼类疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鱼类疫苗的制备方法，尤其涉及一种以壳聚糖纳米微粒为载体的鱼类疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]鱼类疫苗可通过三种途径免疫鱼体:腹腔注射、浸泡和口服。由于养殖面积大，注射需消耗大量的劳动力，对鱼类的损伤也是避免不了的。浸泡则将消耗大剂量的疫苗，疫苗也会因养殖水体中的各种物质所消耗、沉积产生巨大的经济亏损。而口服疫苗，虽然使用不受时间地点和鱼的大小的限制，但当疫苗到达胃肠道后被破坏，又降低了疫苗的免疫效果。但如今口服疫苗又是免疫鱼体最有效，最容易突破的方法，由此新型的疫苗开始蓬勃发展，以疫苗微球技术为例，它是一种用成膜材料把固体或液体包覆成微小粒子的技术，特点是囊心与外界隔绝具有保护功能并且利于囊心的贮存运输。
[0003]口服疫苗微球不仅能够引起全身及黏膜免疫反应，而且给药安全、方便。目前，研宄较多的微球系统有聚乳酸微球、聚羟基乙酸微球、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物微球和聚乳酸-聚乙二醇共聚物微球。但是，这些聚合物载体存在一些问题:(I)载体和抗原的结合需要使用有机溶剂，而有机溶剂会引起抗原变性；(2)属于疏水性聚合物体系，对蛋白质包封率低；抗原蛋白在聚合物载体释放中，突释效应较为明显；(3)聚合物水解降低溶液pH值，使抗原变性。壳聚糖除具有良好的生物黏附性、生物相容性、安全性外，还可以通过打开细胞间紧密连接，增强药物的膜通透性。另外，壳聚糖微球在酸性环境下稳定，不会破坏抗原，加载抗原时只需在水相中混合，不必与有机溶剂接触。由于壳聚糖具有以上诸多优良性能，使其成为口服疫苗载体的首选对象。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种使用壳聚糖作为载体的鱼类疫苗的制备方法，可以很好地包覆疫苗，作为鱼类疫苗载体，该方法所需设备少，反应条件温和，成本低，包封率高，产品的安全性好。
[0005]本发明是通过如下技术方案实现的:
一种鱼类疫苗的制备方法，包括如下步骤:
(1)取醋酸钠54.6g，加lmol/L醋酸溶液20ml进行溶解，再加水稀释至500ml，制得pH=6.0的乙酸/乙酸钠缓冲液；
(2)用步骤(I)制得的乙酸/乙酸钠缓冲液作为溶剂溶解壳聚糖，制得浓度为2mg/ml的壳聚糖溶液；再向2mg/ml的壳聚糖溶液中加入TWeen80，使得壳聚糖溶液中TWeen80的质量分数为0.5-1.5 % ；
(3)取3ml鱼类疫苗药液与2-5ml浓度为50mmol / L的硫酸钠溶液混匀，加入到8-12 ml步骤(2)制得的壳聚糖溶液中，边加边搅拌，搅拌速度为800r/min，再向其中逐滴滴加2mg/ml的三聚磷酸钠溶液3-8ml，溶液变成乳光悬液，再向其中逐滴滴加复合醇0.3-0.6ml，继续搅拌8-15min，进行超声分散，得到分散液；
(4)将步骤(3)得到的分散液再以10000r/min的转速高速离心20min，取离心后的沉淀用蒸馏水进行洗涤，再向洗涤后的沉淀中加入NaCl和蒸馏水，使NaCl的质量分数为0.9%，即得；
所述的复合醇中各原料体积比为乙醇:1，2-丙二醇=1:5-8。
[0006]壳聚糖分子中含有游离氨基，其氮原子上存在I对孤对电子，使氨基呈弱碱性，所以壳聚糖能结合I个氢原子，成为带正电荷的电解质。在制备口服疫苗微球过程中，壳聚糖微球通过氢键、疏水作用以及离子间相互作用结合抗原蛋白质，具有较高的包封率，加入特定比例的复合醇可进一步提尚包封率。
[0007]壳聚糖能和带负电的三聚磷酸盐在非常温和的条件下，通过离子胶凝作用形成纳米粒；而且可通过静电作用将大量蛋白包裹进这种纳米粒中。
[0008]本发明使用pH为6的乙酸/乙酸钠缓冲液溶解壳聚糖，使得溶液的PH不会过低，减小了在鱼类疫苗药液混合的过程中PH过低对疫苗的破坏。
[0009]本发明利用粒子凝胶制备包覆鱼类疫苗的壳聚糖纳米微粒，反应条件温和，制备方法简单，使用设备少，具有不破坏抗原、包封率高的优点。
[0010]具体实施
实施例1:一种鱼类疫苗的制备方法，包括如下步骤:
(1)取醋酸钠54.6g，加lmol/L醋酸溶液20ml进行溶解，再加水稀释至500ml，制得pH=6.0的乙酸/乙酸钠缓冲液；
(2)用步骤(I)制得的乙酸/乙酸钠缓冲液作为溶剂溶解壳聚糖，制得浓度为2mg/ml的壳聚糖溶液；再向2mg/ml的壳聚糖溶液中加入TWeen80，使得壳聚糖溶液中TWeen80的质量分数为I % ;
(3)取3ml鱼类疫苗药液与3ml浓度为50mmol/ L的硫酸钠溶液混匀，加入到1ml步骤(2)制得的壳聚糖溶液中，边加边搅拌，搅拌速度为800r/min，再向其中逐滴滴加2mg/ml的三聚磷酸钠溶液5ml，溶液变成乳光悬液，再向其中逐滴滴加复合醇0.5ml，继续搅拌lOmin，进行超声分散，得到分散液；
(4)将步骤(3)得到的分散液再以10000r/min的转速高速离心20min，取离心后的沉淀用蒸馏水进行洗涤，再向洗涤后的沉淀中加入NaCl和蒸馏水，使NaCl的质量分数为0.9%，即得；
所述的复合醇中各原料体积比为乙醇:1，2-丙二醇=1:6。
[0011]用考马斯亮蓝法测定包封率为95.6%。
[0012]实施例2:—种鱼类疫苗的制备方法，包括如下步骤:
(1)取醋酸钠54.6g，加lmol/L醋酸溶液20ml进行溶解，再加水稀释至500ml，制得pH=6.0的乙酸/乙酸钠缓冲液；
(2)用步骤(I)制得的乙酸/乙酸钠缓冲液作为溶剂溶解壳聚糖，制得浓度为2mg/ml的壳聚糖溶液；再向2mg/ml的壳聚糖溶液中加入TWeen80，使得壳聚糖溶液中TWeen80的质量分数为0.5 % ;
(3)取3ml鱼类疫苗药液与2ml浓度为50mmol / L的硫酸钠溶液混匀，加入到8 ml步骤(2)制得的壳聚糖溶液中，边加边搅拌，搅拌速度为800r/min，再向其中逐滴滴加2mg/ml的三聚磷酸钠溶液3ml，溶液变成乳光悬液，再向其中逐滴滴加复合醇0.3 ml，继续搅拌8 min，进行超声分散，得到分散液；
(4)将步骤(3)得到的分散液再以10000r/min的转速高速离心20min，取离心后的沉淀用蒸馏水进行洗涤，再向洗涤后的沉淀中加入NaCl和蒸馏水，使NaCl的质量分数为0.9%，即得；
所述的复合醇中各原料体积比为乙醇:1，2-丙二醇=1:5。
[0013]用考马斯亮蓝法测定包封率为91.2%。
[0014]实施例3:—种鱼类疫苗的制备方法，包括如下步骤:
(1)取醋酸钠54.6g，加lmol/L醋酸溶液20ml进行溶解，再加水稀释至500ml，制得pH=6.0的乙酸/乙酸钠缓冲液；
(2)用步骤(I)制得的乙酸/乙酸钠缓冲液作为溶剂溶解壳聚糖，制得浓度为2mg/ml的壳聚糖溶液；再向2mg/ml的壳聚糖溶液中加入TWeen80，使得壳聚糖溶液中TWeen80的质量分数为1.5 % ;
(3)取3ml鱼类疫苗药液与5ml浓度为50mmol / L的硫酸钠溶液混匀，加入到12 ml步骤(2)制得的壳聚糖溶液中，边加边搅拌，搅拌速度为800r/min，再