金黄色葡萄球菌sdre cnab结构域及其用于接种的用图
【专利说明】金黄色葡萄球菌SDRECNAB结构域及其用于接种的用途
[0001] 本申请要求2012年10月29日提交的UK临时申请1219420. 5的权益，其所有的 完整内容出于所有目的由此通过引用并入本文。
技术领域
[0002] 本发明涉及金黄色葡萄球菌免疫原的领域。
【背景技术】
[0003] 针对金黄色葡萄球菌的各种疫苗目前正在研宄，例如，参见参考文献1。如参考文 献2中公开的一种方法使用含有CnaB结构域的多肽。该结构域首次在金黄色葡萄球菌胶 原结合表面蛋白中被描述为不介导胶原结合的区域。参考文献2中的图28显示，来自金黄 色葡萄球菌SdrD蛋白的CnaB结构域在小鼠模型中赋予针对菌株USA300感染的保护。
[0004] 本发明的一个目标是提供用于引发针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的进一步且 改进的免疫原。
【发明内容】
[0005] 参考文献2将金黄色葡萄球菌的SdrD蛋白鉴定为含有CnaB结构域。本发明人已 发现，金黄色葡萄球菌富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白（SdrE)含有三个 CnaB结构域（' CnaBEl'、' CnaBE2'和' CnaBE3'），并且这些结构域中的第三个提供针对金黄 色葡萄球菌感染的显著保护，如肾脓肿形成的减少所表明。此外，本发明人已显示甚至针对 不表达SdrE的菌株的交叉保护。此外，已显示SdrE蛋白对于胰蛋白酶消化相对耐受，这可 以与SdrE在其第三CnaB结构域内（即CnaBE3内）含有异肽键的观察联系起来。
[0006] 在第一个方面，本发明提供包含SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽不包含 全长SdrE蛋白。
[0007] 在第二个方面，本发明提供包含SdrE CnaBE3结构域的多肽，其中所述多肽具有少 于500个氨基酸。
[0008] 在第三个方面，本发明提供包含金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的片段的多肽，其中： (a)所述片段包括SdrE CnaBE3结构域；且（b)所述多肽不包含全长SdrE蛋白。
[0009] 在第四个方面，本发明提供包含金黄色葡萄球菌CnaB结构域的多肽，其中所述 CnaB结构域包括异肽键。所述CnaB结构域优选为CnaBE3。
[0010] 在第五个方面，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多 肽，其中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有天冬酰胺残基的一个或多个 氨基酸位置，突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。
[0011] 类似地，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多肽，其 中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有天冬氨酸残基的一个或多个氨基 酸位置，突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。
[0012] 类似地，本发明提供包含突变体金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域的多肽，其 中，在其中天然金黄色葡萄球菌SdrE CnaBE3结构域具有赖氨酸残基的一个或多个氨基酸 位置，突变体具有（i)氨基酸缺失或（ii)氨基酸取代。
[0013] 在第六个方面，本发明提供包含至少两个CnaB结构域的多肽，其中：(a) CnaB结构 域中的至少一个是CnaBE3结构域且至少一个CnaB结构域不是SdrE CnaB结构域；或（b) 所述多肽包含至少两个CnaBE3结构域。此类多肽可包含如参考文献2 (例如，参见其中第 9-13页）中公开的氨基酸序列A (LB)n，条件是至少一个A和/或B是CnaBE3结构域。
[0014] 本发明的这些多肽可用作用于引起免疫应答例如以保护免于金黄色葡萄球菌感 染的免疫原性组合物的组分。
[0015] SdrE 金黄色葡萄球菌SdrE蛋白是富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白，如参 考文献3-8中更详细地讨论。在金黄色葡萄球菌细菌中，其被锚定在细胞壁中。在Newman NWMN_0525菌株中，其氨基酸序列是SEQ ID N0:1 :
[0016] 来自许多更多菌株的SdrE序列是本领域已知的。在申请时搜索 NCBI多肽序列数据库中的金黄色葡萄球菌SdrE序列揭示73次命中，并且使 用SEQ ID NO: 1的BLINK搜索给出至少以下菌株的SdrE序列：COL (序列登录号
[0017] BLINK命中具有1131-1166个氨基酸，其中该长度变异的大部分源自Ser-Asp重复 的长度差异。除了该变异和5聚体PSTSE序列（SEQ ID N0:44)的存在或不存在以外，该序 列另外在许多菌株之间是非常高度保守的。因此，新生序列通常可以如下代表： |SEQ ID ND; 21-Xs-ISEQIDNO; 3|-X'-[SEQ ID NO:4J (式 ） 其中： SEQ ID N0:2 为：
X1是任选的PSTSE序列（SEQ ID NO: 44)，且 X2是20-250个氨基酸长且或者是（i) SD的多个重复或（ii) SD和AD序列两者的混 合物。
[0018] 因此，SEQ ID NO: 1是式'A'的实例，其中X1存在且X 2是SD的83个重复。
[0019] 本发明可以使用任何这些已知的SdrE序列。通常，本发明使用的SdrE将包含与 SEQ ID NO: 3具有至少90%同一性（例如，之91%同一性，之92%同一性，之93%同一性，之94% 同一性，295%同一性，296%同一性，297%同一性，298%同一性，299%同一性，或100%同一 性）的序列，并且，当施用于人或小鼠时，将引发抗体，所述抗体识别作为SEQ ID N0:1表达 的野生型金黄色葡萄球菌蛋白。
[0020] 当本发明的一个实施方案利用金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的片段时，该片段将通 常是与SEQ ID N0:3具有至少90%同一性（例如，之91%同一性，之92%同一性，之93%同一性， >94%同一性，295%同一性，》96%同一性，297%同一性，》98%同一性，299%同一性，或100% 同一性）的序列的片段。包含所述片段的多肽，当施用于人或小鼠时，将引发抗体，所述抗 体识别作为SEQ ID NO: 1表达的野生型金黄色葡萄球菌蛋白。
[0021] 金黄色葡萄球菌SdrE的一种有用片段包括CnaBE3结构域（参见下文），但包括少 于20个Ser-Asp重复。
[0022] 当本发明的一个实施方案不利用全长SdrE蛋白时，它不利用具有式'A'的蛋白。
[0023] 此外，本发明的多肽通常将不包含式'B'的氨基酸序列，其中式'B'为：
SEQ ID N0:3 为：
X1是任选的PSTSE序列（SEQ ID NO:44)(优选存在），且 X2是20-250个氨基酸长且或者是（i) SD的多个重复或（ii) SD和AD序列两者的混 合物（且其中优选的X2是由SD的83个重复组成的166聚体（mer))。
[0024] 因此，式'B'的优选实例是SEQ ID NO:7,1076聚体：
所以，本发明的多肽通常将不包含SEQ ID N0:7。
[0025] CnaB 结构域 CnaB结构域是公认的具有希腊钥匙拓扑学的两个折叠（sheets)中七股的前白蛋白 样夹心折叠的蛋白结构[9]。SCOP数据库[10]包括"Cna蛋白B型结构域"作为家族 (49479)和超家族（49478)两者。在Pfam数据库[11]中，CnaB结构域是条目PF05738。 尽管CnaB结构域基于二级蛋白结构定义，但该结构源于容易分析的氨基酸模式，并且一个 CnaB结构域的存在可以仅仅基于氨基酸序列相对容易地预测，并且它们通过保守结构域搜 索例如使用CDD (保守结构域数据库）容易鉴定，如参考文献12中所报道。
[0026] 各种细菌物种中的CnaB结构域的实例公开于参考文献2。本发明涉及包括CnaB 结构域的金黄色葡萄球菌蛋白。金黄色葡萄球菌中存在几种此类蛋白的实例，包括原型CNA 胶原粘附素（其通常不作为本发明的实施方案），但本发明的主要焦点是Sdr蛋白（富含 Ser-Asp的蛋白，诸如SdrA、B、C、D、E和/或F)，特别是SdrE 0
[0027] 金黄色葡萄球菌SdrE如上文讨论。其含有三个CnaB结构域，在参考文献3中鉴 定为"B重复"。三个CnaB结构域的边界基于Newman菌株显示于参考文献3的图3中，且 SEQ ID N0:1 中的第三 CnaB 结构域（，CnaBE3，）如下（SEQ ID N0:8):
[0028] 使用SEQ ID NO: I与来自任何其他金黄色葡萄球菌菌株的SdrE序列的比对，SEQ ID N0:8允许CnaBE3结构域在该其他菌株中容易地定位。本发明可以使用来自任何此类菌 株的CnaBE3结构域，尽管Newman菌株是优选的。
[0029] 通常，因此，本发明利用的CnaBE3结构域将与SEQ ID N0:8具有至少95%同一性 (例如，296%同一性，297%同一性，298%同一性，299%同一性，或100%同一性），并且，当施 用于人或小鼠时，将引发识别表位的抗体，所述表位（i)在SEQ ID NO: 8内或（ii)包括SEQ ID N0:8内的氨基酸。换言之，CnaBE3结构域将引发与上述鉴定的野生型CnaBE3结构域交 叉反应的抗体。在一些实施方案中，表位在SEQ ID N0:27内或包括SEQ ID N0:27内的氨 基酸。
[0030] SEQ ID NO:8的CnaBE3结构域是111聚体，因此占总SdrE蛋白的约9. 5%。因 此，包含CnaBE3结构域的本发明的多肽可以比全长SdrE蛋白实质上更短。本发明的含有 CnaBE3的多肽可以因此具有少于500个氨基酸，例如，少于400aa，少于350aa，少于300aa， 少于250aa，少于200aa，或少于150aa。
[0031] 当本发明的多肽包括CnaBE3结构域时，所述结构域上游和/或下游的任何氨基酸 可以与金黄色葡萄球菌SdrE蛋白的上游/下游残基相同，或者它们可以不同。例如，当所 述多肽包含序列{A} - {B} - {C}(其中{B}是CnaBE3结构域）时：(a) {A}的C端与SEQ ID NO: 1的残基102-111可以是相同或不同的；和/或（b) {C}的N端与SEQ ID NO: 1的残基 941-951可以是相同或不同的。因此，{B}的CnaBE3结构域可以作为来自SdrE的特定片 段，或者其可以包括作为来自SdrE的较大片段的部分。当序列{c}存在时，这理想地包括 少于20个Ser-Asp重复，例如，少于10个，少于5个，或甚至零个。在一个有用的实施方案 中，序列{A}的确包括CnaBE2结构域内对应区域的短部分，例如，至多达20个氨基酸。例 如，一种有用的序列（SEQ ID NO:27)保留来自CnaBE2的最后15个氨基酸，以得到SEQ ID NO: 1的126聚体片段：
[0032] 来自SdrE的每个CnaB结构域包括EF手环，其可提供钙的高亲和力结合。因此， 本发明的多肽可包括CnaB结构域内的Ca'
[0033] 所述CnaBE3结构域刚好在参考文献1中公开的'SdrE53_ 632 '蛋白的下游。
[0034] SEQ ID NO:8与参考文献2中作为SEQ ID NO: 134-138公开的来自SdrD的五个 CnaB结构域具有序列同一性（通过CLUSTALW计算）：
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[0035] 类似地：当SEQ ID NO:8针对SdrD中的对应区域（例如对于Newman菌株，针对 SdrD的氨基酸1013-1123)比对时，其具有94. 6%同一性，具有6个氨基酸差异；并且当SEQ ID NO:8针对SdrC中的对应区域（例如，针对参考文献1中SdrC的氨基酸607-717)比对 时，其也具有94. 6%同一,性，再次具有6个氨基酸差异。
[0036] 异肽键和突变体CnaBE3结构域 本发明使用的CnaB结构域（并且特别是CnaBE3结构域）可以有用地包括异肽键，即 两个氨基酸的侧链之间的键，或一个氨基酸的侧链和肽链的游离端之间的键。通常，这在一 个侧链中的氨基和另一个侧链上的羧基或甲酰胺（carboxamide)基之间，例如在Lys上的 氨基和Gln或Asn上的甲酰胺之间，或Lys上的氨基和Glu或Asp上的羧基之间形成。形 成异肽键的两个氨基酸通常都在相同CnaBE3结构域中。
[0037] 然而，在一些实施方案中，CnaB结构域（并且特别是CnaBE3结构域）被突变以去 除野生型天冬酰胺和/或赖氨酸残基，由此破坏异肽键的形成。在此类突变体CnaB结构域 中，在天然结构域具有天冬酰胺/赖氨酸残基的一个或多个氨基酸位置，突变体具有（i)氨 基酸缺失或（ii)氨基酸取代。SEQ ID NO: 9至14是其中野生型Asn残基突变的CnaBE3结 构域的实例，其中'X'不是'N'（并且理想地不是'N'、'Q'、'D'或'E'）：
[0038] 类似地，SEQIDNO: 15至26是其中野生型Lys残基突变的CnaBE3结构域的实例， 其中'X'不是'K' ：
[0039] 这些突变体可抵抗异肽键的形成。
[0040] 然而，在本发明的一些实施方案中，天然的赖氨酸和/或天冬酰胺和/或天冬氨酸 残基得到保留，使得异肽键形成得到维持。具体而言，保留对应于SEQ ID N0:8内的Asn-104 的位置（即SEQ ID NO: 14中加下划线的位置）的天冬酰胺是有用的。
[0041] 与金黄色葡萄球菌糖类的组合 本发明的多肽可以与缀合的金黄色葡萄球菌糖抗原组合使用。因此，本发明提供包含 以下的组合的免疫原性组合物：（1)本发明的多肽；和（2)金黄色葡萄球菌外泌多糖和载 体蛋白的一种或多种缀合物。
[0042] 该组合的组分（2)中使用的缀合物包括糖部分和载体部分。所述糖部分来自金黄 色葡萄球菌的外泌多糖，其是聚-N-乙酰葡糖胺（PNAG)。所述糖可以是具有在从细菌纯化 外泌多糖的过程中出现的大小的多糖，或者它可以是通过此类多糖的片段化获得的寡糖， 例如，大小可以从超过400kDa变化至75和400kDa之间，或10和75kDa之间，或至多达30 个