鼻咽癌诊治标志物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及鼻咽癌诊治标志物及其应用，更具体的 涉及mir-326和/或miR-326在诊治鼻咽癌中的新用途。
【背景技术】
[0002] miRNA通常由RNA聚合酶II (Pol II)转录生成。Pol II结合在以后形成发夹结 构的颈环DNA序列附近。生成的转录本经修饰添加5'帽子结构和3'末端多腺苷酸尾巴结 构，并剪切，生成的产物称为初级miRNA (pri-miRNA)，该产物可能长达数千或数百核苷酸， 可能包含多个miRNA环结构。
[0003] 单个pri-miRNA可能含一到六个miRNA前体。这些发夹结构每个由约70nt左右的 核苷酸组成。每个发卡结构附以部分序列以利于有效剪切处理。pri-miRNA中的双链发夹 RNA 结构被叫做 DGCR8 的核蛋白（DiGeorge Syndrome Critical Region 8)辨认，DGCR8 同 Drosha酶一起形成微处理（microprocessor)复合体。在该复合体中，DGCR8组织Drosha 蛋白的RNase III结构域使其在距离发卡结构约11个核苷酸处切割pri-miRNA，使其释放 发卡结构。释放的发卡结构即为前miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA在3'存在两个悬空的核 苷酸，pre-miRNA 5'为磷酸集团，3'为羟基集团。
[0004] 在胞浆中，pre-miRNA发夹结构经RNase III Dicer切割处理。这种内源性核糖 核酸酶（endoribonuclease)与发夹结构的3'相互作用并在环的3'和5'臂上完成切割， 产生长约22nt并不完美匹配的miRNA :miRNA*双链结构。
[0005] miRNA与靶mRNA的典型作用方式主要有两种。在大多数情况下，复合物中的单 链miRNA与靶mRNA的3' UTR不完全互补配对，阻断靶基因的翻译，从而调苄基因表达。这 种方式主要影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。近来，有研宄对翻译抑制理论提 出质疑，发现被抑制的革G mRNAs和miRNAs共同聚集于胞衆中被称为P小体（processing bodies，P_bodies)的区域，这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。P小体可能是作 为未翻译mRNA进行暂时的可逆储存的容器，减少一些特定P小体组成蛋白的表达能够缓和 miRNA介导的基因表达抑制作用。P小体是胞浆中的一定区域，它包含参与多种转录后过程 的蛋白质，例如：mRNA 降解（mRNA degradation)、无义介导 mRNA 衰退（nonsense-mediated mRNA decay, NMD)，转录抑制及 RNA 介导的基因沉默（RNA-mediated gene silencing)。
[0006] 另一种作用方式与siRNA类似，当miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago2蛋白通过 切割mRNA直接导致其降解，实现基因沉默。以siRNA参与的RNAi为例：siRNA可与RISC结 合，作为模板识别mRNA靶子，通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换 出正义链。双链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22nt左右的siRNA，siRNA 继续同RISC形成复合体，与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。这个过程也 称为转录后基因沉默（PTGS)。
[0007] 总之，当前认为miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程 度有关。miRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑制目的基因的表达发挥作用；miRNA 与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。另 外，miRNAs有时候也导致组氨酸修饰和启动子区的DNA甲基化，从而影响靶基因的表达。除 此外，近来发现快速脱腺苷酸化（accelerated deadenylation)是miRNA抑制基因表达的 新机制。在哺乳动物细胞中发现miR-125b和let-7能够促进mRNA聚腺苷酸尾巴（polyA tail)的去除。用3'组蛋白茎-环结构取代聚腺苷酸尾巴，不但可以消除miR-125b对mRNA 含量的影响，还可以降低对蛋白质合成的作用，可见miRNA能通过降低翻译效率和聚腺苷 酸化mRNA的浓度来抑制基因表达。
[0008] 鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种发生于鼻咽粘膜，具有较高恶性 程度和极强转移能力的恶性肿瘤。鼻咽癌是多基因遗传性疾病，其发病与遗传因素（遗传 易感性）、EB病毒感染、环境因素、饮食习惯等多种因素有关，早期诊断、早期治疗是挽救患 者生命和提高生活质量的最有效手段。遗憾的是，鼻咽癌起病隐匿，具有强烈的转移倾向。 据统计，约75%的患者在就诊时就已到达晚期，发生局部淋巴结和/或远处转移，治疗后复 发或转移则预后极差，成为鼻咽癌治疗失败的主要原因。因此，筛查鼻咽癌的肿瘤标记物， 争取早期发现、选择最佳治疗方案、预测预后、监测复发或转移对鼻咽癌诊疗具有重要的临 床意义。
[0009] 本发明通过高通量测序分析鼻咽癌组织，获得其miRNA表达数据，进而进行生物 信息学分析，选取后备miRNA进行分子生物学验证，结果显示，本发明提供的miRNA和鼻咽 癌密切相关，可用于临床诊断及预防检测，具有很好的实际应用价值。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供mir-326和/或其成熟miRNA在制备预防、诊断和/或治疗 肺腺癌转移试剂中的应用。mir-326的序列见序列表SEQ ID NO 1。mir-326的成熟miRNA 为miR-326其序列见序列表SEQ ID NO 2。
[0011] 进一步，所述的预防、诊断肺腺癌转移试剂包括基于高通量测序方法和/或基于 定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测肺腺癌样本中mir-326和/或miR-326的转 录或基于免疫检测方法检测肺腺癌样本中miR-326调控的靶基因的表达情况，优选采用 northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的 流式细胞术检测肺腺癌样本中mir-326和/或miR-326的转录；采用ELISA和/或胶体金 试纸条检测肺腺癌样本中miR-326调控的靶基因的表达情况。
[0012] 优选的，所述的基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-326和/或miR-326的引 物；所述的基于探针杂交方法包括与mir-326和/或miR-326的核酸序列杂交的探针；所述 免疫检测方法包括与miR-326调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。
[0013] 进一步，所述的治疗肺腺癌转移试剂包括抑制剂和/或抑制剂组合物下调 mir-326和/或miR-326的转录和/或阻断miR-326的活性。
[0014] 优选的，采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA 海绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀点反义寡核苷酸的方法下调mir-326和/或miR-326的转录和/或阻 断miR-326的活性。
[0015] 本发明的目的还在于提供一种抑制肺腺癌转移试剂，其特征在于，所述抑制肺腺 癌转移试剂包含：
[0016] (a)抑制剂和/或抑制剂组合物，所述的抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-326 和/或miR-326的转录和/或阻断miR-326的活性；
[0017] (b)药剂学上能接受的载体。
[0018] 优选的，采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA 海绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多祀点反义寡核苷酸的方法下调mir-326和/或miR-326的转录和/或阻 断miR-326的活性。
[0019] 本发明的目的还在于提供一