罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫 苗、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 无乳链球菌是链球菌属的一个种。1896年按照Lancefield氏血清学分类法把无 乳链球菌归为B群链球菌，因为该群仅有无乳链球菌一种，因此无乳链球菌又称B群链球菌 (GBS)。GBS是重要的人畜共患病的细菌性病原之一，能引起婴儿败血症、脑膜炎等，新生儿 晚发性感染的死亡率可达2 %~6 %。GBS也是动物，包括牛、山羊和绵羊等的急、慢性乳腺 炎的主要病原菌。Robinson等人于1966年第一次报道在淡水鱼金色美鳊（Notemigonus crysoleucas)中分离出B群链球菌。随后相继有包括罗非鱼在内的多种鱼类受无乳链球菌 感染而大量死亡的报道。鱼类受链球菌感染后出现的典型症状之一是运动失控，组织切片 显示链球菌可侵袭鱼类脑部神经系统。罗非鱼是世界性养殖鱼类，也是我国重要的淡水养 殖鱼类，近年来链球菌病给罗非鱼养殖业造成极大的威胁。
[0003] 在链球菌的免疫预防上，以色列的Eldar等人在1993年开发了虹鳟海豚链球菌 (Streptococcus iniae)全菌灭活疫苗，从1995年到1997年，以色列的养殖虹鳟使用该疫 苗进行免疫，每年大约免疫300万尾，使虹鳟因受海豚链球菌感染所致的死亡率由每年的 50%下降至低于5%。但1997年以后，以色列养殖虹鳟暴发的海豚链球菌病，发病症状有 别于以往，原疫苗对此病失去了保护效果。对从1997-2000年连续4年采集的样品进行血 清学分析表明新菌株的血清型与早期的不同，且试验证实这两种血清型疫苗无交叉保护作 用。由于针对某种血清型制备的灭活疫苗难以对所有血清型产生有效的保护作用，因此成 功的无乳链球菌疫苗必须要包含各种血清型均保守的抗原区段。而无乳链球菌的荚膜免疫 被证明保护力低下。
[0004] 鉴于此，克服以上现有技术中的缺陷，提供一种新的无乳链球菌亚单位疫苗成为 本领域亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供了罗非鱼无乳链球菌GapA蛋 白亚单位疫苗、其制备方法及应用。
[0006] 本发明的目的可通过以下的技术措施来实现： 本发明提供了一种罗非鱼无乳链球菌GapA蛋白亚单位疫苗，包括： (i) 如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段；和/或 (ii) 能够编码如以SEQ ID No :1所示的氨基酸序列或其同源物或片段的核酸序列。
[0007] 优选地，该疫苗还包括药物学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
[0008] 优选地，该疫苗还包括弗氏佐剂，所述疫苗为如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的 多肽或其同源物或片段与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂中的一种或两种形成的混合乳化 物。
[0009] 优选地，所述的核酸序列如SEQ ID No :2所示。
[0010] 本发明还提供了一种重组构建体，该重组构建体包含如SEQ ID No :2所示的核酸 序列，所述核酸序列被可操作地连接于表达调控区域。
[0011] 本发明还一种用于制备如SEQ ID No :2所示的GapA蛋白的编码基因的试剂，该试 剂包括核苷酸序列如SEQ ID No :3和SEQ ID No :4所示的引物。
[0012] 本发明还提供了一种制备上述的疫苗的方法，其包括如下步骤： (a) 使用上述的试剂扩增得到GapA蛋白的编码基因 SEQ ID No :2 ; (b) 获得含有GapA蛋白的编码基因 SEQ ID No :2的重组构建体； (c) 用所得重组构建体转化宿主细胞； (d) 将转化后的宿主细胞置于足以表达所述GapA蛋白的编码基因的条件下进行培养； (e ) GapA蛋白的分离纯化。
[0013] 本发明另外还提供了如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段 在制备用于预防和/或治疗罗非鱼链球菌病药物中的用途。
[0014] 本发明的有益效果在于，本发明的疫苗具有良好的免疫原性、安全性高、使用方 便。
【附图说明】
[0015] 图1是实施例1中GapA基因 PCR扩增结果图。
[0016] 图2是实施例1中GapA基因重组质粒酶切鉴定结果图。
[0017] 图3是实施例1中GapA蛋白的Western-blot结果图。
[0018] 图4是应用例1的罗非鱼免疫后累计死亡率统计图。
[0019] 图5是本发明的疫苗的制备过程的具体流程图。
【具体实施方式】
[0020] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施 例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。
[0021] 本发明的实验材料无乳链球菌取样自受无乳链球菌感染的罗非鱼体内，为野生型 无乳链球菌。
[0022] 术语"多肽"以正常的意义使用，指通过相邻氨基酸的α -氨基和羧基基团之间的 肽键彼此连接的一系列残基，通常是L-氨基酸，该术语与"蛋白质"是同意的。多肽可以从 其天然环境分离，例如，从罗非鱼无乳链球菌提取或在罗非鱼无乳链球菌外部生成。
[0023] 术语"同源物"指可源自另一品系或物种的多肽，其与初始蛋白质实施相同的功 能，和/或可以预测为就其序列而言共享共同的进化史。
[0024] 术语"片段"指多肽包含野生型氨基酸序列的部分。它可以包含序列的一个或多 个大的连续部分或多个小的部分。多肽也可以包含序列的其他元件，例如，它可以是与另一 种蛋白质的融合蛋白。片段可以包含野生型序列的至少50%，更优选地至少65%，最优选地 至少80%。片段可以是或包含主题序列的亚单位。
[0025] 同源蛋白质（或其片段）可以通过序列同源性(包括至关重要的残基的位置)、结 构、生物物理、生物化学或功能性同源性来鉴定。
[0026] 同源序列可以通过保守推定结构或氨基酸序列间的相似性，使得使用BLASTp比 较的比对在全序列的相当一部分间产生le-20或更小的E值。
[0027] 同源序列可以通过氨基酸序列间的相似性或保守的推定结构来鉴定。
[0028] 术语"核酸"可以是任何合适类型的核苷酸序列，如合成的RNA/DNA序列、重组 RNA/DNA序列（g卩，通过使用重组DNA技术制备)、cDNA序列或部分基因组DNA序列。核酸可 以自其天然环境分离，例如，从罗非鱼无乳链球菌提取或在罗非鱼无乳链球菌外部生成。
[0029] 关于GapA (三磷酸甘油醛脱氢酶）蛋白 GapA蛋白是链球菌的具有三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH)活性的蛋白，最早在A族链 球菌中发现，GAPDH是糖酵解过程中的关键酶，该酶存在于细胞表面，能结合细胞分子，在 引发癌症及细胞凋亡方面其重要作用。链球菌具有单拷贝的GAPDH基因，该单拷贝基因 对细菌的生存是至关重要的。目前已发现能合成GAPDH的链球菌有A族链球菌（plasmin receptor，Pit)，B组链球菌、C组链球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、肺炎链球菌、猪链球菌I 型、猪链球菌II型、口腔链球菌等。
[0030] 以SEQ ID No :1显示的多肽(蛋白质）可源自罗非鱼无乳链球菌，此蛋白质显示出 了 GapA蛋白的活性。
[0031] 以SEQ ID No :2显示的核酸序列可源自罗非鱼无乳链球菌，此核酸序列为GapA蛋 白的编码基因。
[0032] 关于弗氏佐剂 弗氏佐剂（Freundad j uvan t)是目前常用于动物实验的佐剂，它是将抗原水溶液与油 剂(石蜡油或植物油）等量混合，再加乳化剂（羊毛脂或叶吐温80)制成油包水抗原乳剂，称 之为不完全弗氏佐剂。如在不完全佐剂中加入分枝杆菌(如死卡苗）则称为完全弗氏佐剂。 其制备方法如下：弗氏佐剂是现在动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全 弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1~5 :1，可根据需要 而定，通常为2 :1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2~20mg/mL)或死的结核分枝杆 菌，即为完全弗氏佐剂（FCA)。在本发明的实施例中，一般首次注射时用1 / 2体积FCA加 上1 / 2体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂，如不加佐 剂，要达到同样的免疫或治疗效果，抗原用量要增大10~20倍。
[0033] 本发明的第一方面涉及一种疫苗，其可以包括多种氨基酸/核酸序列，其对应来 自于罗非鱼无乳链球菌的不同品系和/或物种的SEQ ID No :1同源物和/或能够编码如以 SEQ ID No :1所示的氨基酸序列或其同源物或片段的核酸序列。
[0034] 疫苗还可以包括药物学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂，例如，疫苗还包括弗 氏佐剂，该疫苗为如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或片段与完全弗氏 佐剂、不完全弗氏佐剂中的一种或两种形成的混合乳化物。更一步地，该多肽与弗氏佐剂的 体积比为1 :(1~2);进一步地，该多肽与弗氏佐剂的体积比为1 :1 ;更进一步地，该疫苗可 进行二次免疫，第一次免疫使用体积比为1:1的多肽与完全弗氏佐剂混合物，第二次免疫 使用体积比为1:1的多肽与不完全弗氏佐剂的混合物。
[0035] 疫苗可以用于预防和/或治疗疾病；"预防"意指对尚未染上疾病和/或没有显 示任何疾病症状的受试者施用疫苗以阻止或削弱疾病(例如感染）的原因或者降低或阻止 至少一种与疾病有关的症状的形成；"治疗"（"处理"）意指对具有现有疾病的受试者施用 疫苗以减轻、减少或改善至少一种与疾病有关的症状和/或减缓、降低或阻断疾病的进展。 如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列的多肽直接用作免疫原进行罗非鱼免疫接种，能够降低 罗非鱼的死亡率，显示出了良好的免疫原性(参见实施例1)。
[0036] 本发明第二方面提供了一种重组构建体，其包含如SEQ ID No :2所示的核酸序列， 所述核酸序列被可操作地连接于表达调控区域。
[0037] 本发明第三方面提供了一种用于制备如SEQ ID No :2所示的GapA蛋白的编码基 因的试剂，其包括核苷酸序列如SEQ ID No :3和SEQ ID No :4所示的引物。
[0038] 本发明第四方面提供了一种制备上述疫苗的方法，其主要包括如下步骤：（a)使 用上述的试剂扩增得到GapA蛋白的编码基因 SEQ ID No :2 ; (b)获得含有GapA蛋白