一种口蹄疫疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种口蹄疫疫苗的制备方法，为一种新型的口蹄疫疫苗细胞培养液纯 化工艺。属于兽用生物制品制造领域。
【背景技术】
[0002] 口 蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth disease virus，FMDV)引起偶蹄动 物感染的一种急性、高度接触性、发热性传染病（Bachrach HL. Foot-and-mouth disease virus[J]. Ann Rev Microbiol,1968, 22:201-244.)(Domingo E, Baranowski E, Escarrnrs C, etal. Foot-and-mouth disease virus[J].Comp. Immun. Microbiol-Infect. Dis，2002, 25:297-308.)，对养殖业危害极大，国际兽医局将其列为A类传染病之 首，是世界动物卫生组织（OIE)规定必报的传染病之一。FMDV属于小RNA病毒科， 口蹄疫病毒属，该病毒有七个血清型，分别为〇、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia 1型 (Martinez, MA, CarriloC, Plana J, MascarellaR, Bergada J1Palma EL1Domingo E, Sobrino F. Genetic and immunogenic variations among closely related isolates of foot-and-mouth disease virus [J] · Gene, 1988, 62:75-84.)，其中在我国流行的主要是 0 型FMDV和Asia 1型FMDV。大多数发展中国家对FMD的预防和控制主要采用普遍免疫接种 的方法。目前我国广泛使用的FMD疫苗主要是灭活疫苗，研制安全、有效的FMD新型疫苗成 为各国研宄的重点。
[0003] 现行口蹄疫病毒灭活疫苗免疫效力不稳定，疫苗注射后免疫持续期短，其 主要原因是疫苗中有效抗原（146S抗原）含量低（T R Doel. FMD vaccines. Virus Research, 2003, 91:81-89.)。为提高疫苗的免疫效力，通常采用对抗原浓缩的办法，常规方 法的缺点是有效抗原在纯化过程中的损失太大，不良反应得到改善但疫苗的免疫效果却降 低了。
[0004] 生产中期望BHK21细胞病毒培养物的收获技术以高收率和最小细胞破裂的方式 操作。随着产物分子滴度的增加，较高的细胞团和较大量的产物对下游纯化步骤提出挑战， 较高的细胞团在澄清和无菌过滤期间造成困难，较高的产物浓度一般导致增加的杂质负 荷。目前，口蹄疫灭活疫苗仅用离心工艺技术去除有限的细胞碎片，该方法处理的口蹄疫病 毒细胞培养物含有非目的蛋白的大量残留，同时这一工艺方式使得抗原在处理过程中损失 较大，另外，离心清洁程序减慢工厂生产不同毒株口蹄疫病毒的能力，并且大大增加了生产 运行之间交叉污染的风险。
【发明内容】
[0005] 本发明的技术方案为：
[0006] 1. -种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：收获病毒的细 胞培养液，使用深层过滤装置进行过滤，滤液使用中空纤维柱或膜包进行超滤浓缩，经过两 步层析柱进行抗原纯化，过滤除菌后灭活、阻断，加206佐剂乳化，分装即得。
[0007] 2.如权利要求1所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
[0008] (1) 口蹄疫病毒细胞培养液经深层过滤装置处理，即：病毒细胞培养液与深层过 滤装置接触，以300L/m2/hr~500L/m 2/hr的流速过滤具有约0. 5pm~200pm的粒径分布的 细胞碎片和颗粒，分离目的抗原与细胞碎片和颗粒；
[0009] (2)用中空纤维超滤系统或膜包浓缩纯化步骤（1)后抗原液；
[0010] (3)按照上述纯化浓缩方法获得的抗原经过DEAE-Sepharose FF和Sephawse6FF 两步层析柱；
[0011] (4)用二乙烯亚胺（BEI)处理（3)后抗原液进行灭活，硫代硫酸钠进行阻断；
[0012] (5)抗原液灭活阻断后与206佐剂混合乳化制成双相油乳剂疫苗。
[0013] 3.如权利要求1所述的一种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于所述深层滤器包 含至少2层非织造纤维的分级层，提供>100L/m 2/hr的通量，去除具有0. 5pm~200pm的粒 径分布的细胞碎片。
[0014] 4.如权利要求1所述的一种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于步骤（2)所述使 用截留分子量为60kd~80kd的中空纤维柱或截留分子量为60kd~80kd的膜包进行浓缩 纯化，再用分子筛层析柱对滤液进行纯化。
[0015] 5.如权利要求1所述的一种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于该方法用于制备 口蹄疫疫苗单价疫苗。
[0016] 6.如权利要求1所述的一种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于该方法用于制备 口蹄疫疫苗多价疫苗。
[0017] 本发明详细描述
[0018] 为了完成上述技术方案，本发明提供了一种高效的口蹄疫病毒细胞培养液浓缩纯 化抗原工艺，包括以下步骤：
[0019] 1.提供口蹄疫疫苗细胞培养液和深层过滤装置：料液与深层过滤装置接触，以 300L/m 2/hr~500L/m2/hr的流速过滤具有约0. 5pm-~200pm的粒径分布的细胞碎片和颗 粒，分离目的抗原与细胞碎片和颗粒。
[0020] (1)本发明提供一种深层过滤装置（瑞士 FILTR0X公司），AF103深层过滤滤滤 膜，包括具有1. 5~0. 5 μπι多个分级的深层滤器介质，用于初步澄清和去除聚集的细胞生 物质，提高未澄清的进料流的通量而没有不期望的滤饼过滤效应；
[0021] (2)AF103滤膜有非常高的深度以分散细胞团，防止会导致介质中的内部滤饼过滤 的内部絮状物桥接，在介质的外部或内部以避免压力的浓度降低引起絮状物分解；
[0022] (3)具有各向异性深层滤器层，即孔径逐步减少，匹配料液中絮状物大小的群体；
[0023] (4)对于平均粒径大于10 μπι的目标抗原的初步澄清（通常是采用絮凝剂和化学 处理的料液的初步澄清）；
[0024] (5) AF103滤膜具有开放标称孔径评级的非织造纤维和纤维素/硅藻土 (diamatoceous earth)的复合分级层，能够过滤具有大量固体的聚合物絮凝剂处理的进料 流；
[0025] (6)AF103滤膜具有较大通透性，但对于聚合物絮凝剂处理的进料流有较好的保持 特性。
[0026] 2.对经AF103滤膜过滤处理后的抗原液再用内径I. 0mm、截留分子量500KD、柱体 积51. 80cm2、规格3. 8X12寸的中空纤维超滤系统，采用阴离子交换层析和分子筛层析柱对 过滤的抗原液进行纯化。
[0027] 较佳地步骤（3)中，用于口蹄疫病毒浓缩用中空纤维分子量规格为60K~80K ;当 循环液体积为原液体积的1/50~1/4,优选为1/20~1/10时，收集中空纤维超滤系统的循 环液，弃去透过液。
[0028] 较佳地，中空纤维的数量为1000~4000根纤维/支膜柱，用于口蹄疫病毒中空纤 维膜柱数是40支。
[0029] 较佳地，可使用膜包进行超滤浓缩，使用中空纤维柱可对病毒液进行50~200倍 的超滤浓缩，使用膜包进行的病毒液超滤浓缩可达50倍。
[0030] 本发明所述的阴离子交换层析柱使用介质为DEAE-Sepharose FF，柱床体积约 10ml，线性流速为100cm/h。
[0031] 本发明所述的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶为GE公司产品，组分收集范围为 1.0 X IO4~1.0 X 10 8球蛋白分子量的高分辨率的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶。更优选为组分 收集范围为I. ox IO4~1.0 X 10 6球蛋白分子量的高分辨率的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶。
[0032] (4)用二乙烯亚胺（BEI)处理（3)后抗原液进行灭活，硫代硫酸钠进行阻断。
[0033] (5)经以上浓缩纯化处理、并经灭活阻断的病毒抗原液按（V/V) 1:6用pH 7. 4~ 8. 0的0.0 lM磷酸缓冲液进行稀释；稀释后的抗原与206佐剂（购自法国S印pic公司）按 (V/V) 46:54的比例混合乳化制成（灭活）油乳剂疫苗（单价）。
[0034] 使用两种或以上病毒抗原液制备多价疫苗，是根据疫情中口蹄疫病毒型的种类， 可分别制备不同亚型口蹄疫病毒株的细胞培养液经以上浓缩纯化处理、灭活阻断后病毒抗 原液按相同等体积混合，再将混合后病毒抗原液按（V/V) 1:6用pH 7. 4~8. 0的0.0 lM磷 酸缓冲液进行稀释；稀释后的抗原与206佐剂（购自法国S印pic公司）按（V/V)46:54的 比例混合乳化制成（灭活）油乳剂疫苗（多价）。
[0035] 本发明使用微生物资源信息
[0036] 本发明疫苗生产用口蹄疫病毒为0NXC/92株、Asial/JSL/GSZY/06株，0/Mya98/ XJ/2010和0/GX/09-7毒株均购自中国农业科学院兰州兽医研宄所。
[0037] 本发明积极意义
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