一种聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种血管组织工程支架材料的制备，具体是涉及一种聚合物/角蛋白抗凝血血管组织工程支架的制备方法。
【背景技术】
[0002]人工合成血管和自体血管是目前临床上小直径(<6mm)血管移植物的主要来源。在实践中人工合成血管存在植入后容易造成血栓形成、内膜增生、远期通畅率不高等问题；自体血管受到供体来源、直径及长度等限制，还无法满足小直径血管移植物的供给需求。组织工程血管为解决小直径血管移植物来源提供了有效的途径，制备可供细胞进行生命活动的支架并对支架材料进行生物学方面的评价是组织工程血管研宄的重要领域。
[0003]快速内皮细胞化策略可长效解决血管组织工程支架的血栓形成问题。原位血管组织工程支架策略能够短期内行使血液输送功能，长期随着支架细胞内生长、自身降解，从而最终形成血管，这种策略是目前最理想的策略。
[0004]原位血管组织工程支架材料要求有一定的机械强度、良好的细胞相容性、良好的抗凝血性。支架表面内皮化既可以促进细胞生长，也可以改善血液相容性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法，将提取的角蛋白与生物可降解聚合物共混纺丝制备复合纤维膜片，所制备的复合纤维膜片作为血管组织工程支架，利用角蛋白在血液环境中的原位催化或诱导内源性NO供体释放NO的能力，从而实现NO释放；进而提高支架的血液相容性和细胞相容性，抑制平滑肌生长，最终原位形成血管。
[0006]为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]一种聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法，其特征在于，提取角蛋白并进行稳定化改性；将改性后的角蛋白与生物可降解聚合物混合，采用静电纺丝法制备所述的聚合物/角蛋白复合血管组织工程支架。
[0008]本发明所用的角蛋白来源为人或动物的毛发。
[0009]本发明中的生物可降解聚合物包括PCL(聚己内酯)、PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)、PLA(聚乳酸)、PHA(聚羟基脂肪酸酯)、PHBV(3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物)、生物可降解PU(聚氨酯)中的一种或者几种。
[0010]具体地，本发明方法包括如下步骤:
[0011]步骤I)角蛋白的提取和改性:将人或动物的毛发洗净后烘干，剪成小段，在pH值为8.0-9.0的还原液中溶胀I?2小时，然后在45?60°C搅拌反应至少12小时，过滤得到角蛋白溶液，透析2-3天；所得的角蛋白溶液中，加入过量的改性剂封端活泼的巯基，反应0.5-2天后，再次透析2-3天，冻干后得到棉花状角蛋白；
[0012]步骤2)血管组织工程支架的制备:将步骤I)得到的改性后的角蛋白和可生物降解聚合物的混合物溶解在有机溶剂中形成混合溶液，采用转筒接收器，静电纺丝法制备管状样品，制得所述的聚合物/角蛋白复合血管组织工程支架。
[0013]上述步骤I)中，所述的还原液优选为巯基乙醇或巯基乙酸、十二烷基硫酸钠和尿素的混合液，所用毛发与还原液的质量体积比为1:50?1:100克/晕升。
[0014]上述步骤I)中，所述的改性剂选自碘代乙酸或(甲基)丙烯酸单体。
[0015]上述步骤2)中，所述的可生物降解聚合物包括PCL、PLGA、PLA、PHA、PHBV、生物可降解PU中的一种或者几种。
[0016]上述步骤2)中，角蛋白和可生物降解聚合物的混合物中，所述的角蛋白所占质量百分比为5%?50%。
[0017]本发明的利用角蛋白构建血管组织工程支架的方法，制得的血管支架为有机高分子血管组织工程支架，主要用于原位法血管组织工程构建血管。角蛋白材料本身具有大量的双硫键，在血液环境中双硫键可以被部分还原，最终催化或诱导内源性NO供体释放NO。角蛋白本身的蛋白质特性，注定其自身具有良好的细胞相容性。从人头发提取的角蛋白，用于人体，还有抗免疫原性。NO是生物体内的一种信息分子，NO能够有效防止血小板在正常血管壁上的粘附和活化，具有显著的抗凝血效果。更加重要的是，NO还能够抑制平滑肌细胞的增殖，有助于减少血管再狭窄。
[0018]本发明所述的方法，不仅用于原位血管组织工程支架制备，还可用于与血液接触的其它医疗器械。
[0019]本发明的优点在于:(I)角蛋白来源丰富，尤其是人发角蛋白；(2)角蛋白本身具有良好的细胞相容性；(3)角蛋白在血液环境中的原位催化或诱导内源性NO供体释放NO，促进内皮细胞生长同时，抑制平滑肌细胞生长；(4)抗血栓形成；(5)生物可降解；(6)排异反应小。根据本发明方法制备抗血栓形成、生物可降解、组织和细胞相容性好、无免疫原性、具有一定的强度和生长性的支架，为小口径血管组织工程支架的制备提供理论与实验依据。
[0020]下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以【具体实施方式】为限，而是由权利要求加以限定。
【附图说明】
[0021]图1本发明制备的聚合物/角蛋白复合膜片的SEM形貌图；A)PCL，B)PCL/角蛋白。
[0022]图2本发明制备的聚合物/角蛋白复合膜片的ATR-FTIR图谱。
[0023]图3本发明制备的聚合物/角蛋白复合膜片的细胞相容性。
[0024]图4本发明制备的聚合物/角蛋白复合膜片的NO释放能力。
【具体实施方式】
[0025]下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对
【发明内容】
的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
[0026]实施例1
[0027]聚合物/角蛋白复合抗凝血血管组织工程支架的制备方法，依次包括以下步骤:
[0028]①角蛋白还原并稳定化
[0029]人发经过碱和甲醇依次洗涤，除去油污。剪碎人发粗品(Ig)，放入烧瓶中，加入巯基乙醇(3g)，尿素(20g)，十二烷基磺酸钠(1.5g)，溶胀I?2小时，加热到50°C，反应12h。透析2天后，过滤得到角蛋白溶液。测定透析后角蛋白的巯基含量，根据体积计算得到巯基的总量，并加入过量的改性剂(碘代乙酸)稳定巯基，避光常温反应12小时，再次透析3天，冻干得到改性后的角蛋白。
[0030]②静电纺丝构建血管组织工程支架
[0031]取聚合物PCL和角蛋白共混，其中角蛋白质量比例为10%，溶解于有机溶剂六氟异丙醇中形成聚合物溶液。优化条件下，纺丝浓度为10%，纺丝电压为10kV，接收板距离15cm，静电纺丝