一种基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程与再生医学技术领域，具体涉及一种以大网膜脱细胞基质为支架材料的组织工程皮肤及其构建方法。
【背景技术】
[0002]皮肤是保护机体免受外界侵袭的首要屏障，在维持机体内环境稳定中发挥着极其重要的作用。严重创伤、大面积烧伤、肿瘤摘除等引起皮肤缺损的传统的治疗方法为皮肤移植，然而目前皮肤移植存在供体来源不足以及免疫排斥反应等问题，因此迫切需要一种理想的皮肤替代物来修复损伤皮肤。通过组织工程方法，利用细胞以及细胞外基质能够构建出具有一定功能的人工皮肤，为构建皮肤替代物以及皮肤损伤临床修复提供了新的方法。
[0003]组织工程皮肤为修复皮肤缺损创面带来了希望，目前，部分组织工程皮肤产品已应用于临床，如Integra、Dermagraft> Alloderm等组织工程皮肤产品，具有巨大的发展潜力。然而其移植存活率明显低于自体皮肤移植，临床效果依然不甚明显。主要原因在于组织工程皮肤很大程度上受制于移植后缺乏足够的血管化而导致缺血损伤，进而造成的细胞供养不足，甚至移植失败。
[0004]正因如此，国内外研宄人员在组织工程皮肤血管化方面开展了大量研宄。目前，促进组织工程皮肤血管化的方法主要包括促血管生成因子的直接应用、添加血管内皮细胞、编码特定生长因子基因转染种子细胞等。上述方法在解决组织工程皮肤血管化方面发挥了一定作用，然而也存在明显的局限性。例如，在组织工程皮肤构建时添加血管外源性内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等调控因子，虽然能趋化宿主内皮细胞，促进工程化皮肤的血管化。然而，外源性生长因子价格昂贵，体内半衰期短，且高剂量应用时可能导致血液流变异常，进而产生严重副作用。而在构建工程化皮肤时添加血管内皮细胞的方法也存在自体来源内皮细胞来源有限以及取材过程对机体产生创伤等不足，不仅如此，血管内皮细胞多为终末分化细胞，其增殖的能力与细胞因子分泌能力均存在不足，限制了于组织工程皮肤的应用。编码特定生长因子基因转染种子细胞亦存在安全性等问题。因此，亟需寻找能够促进组织工程皮肤血管化的新方法与策略。
[0005]脱细胞技术的出现为组织工程皮肤的构建及其血管化带来了新的希望。利用脱细胞技术去除组织中各种细胞成分以及遗传物质而获得的天然生物支架材料及脱细胞基质材料，保留了细胞外基质的三维结构和天然成分，有利于细胞粘附、增殖、分化及其生物学功能的发挥，在组织修复与再生中具有其他支架材料无法比拟的优势。目前，研宄人员已经获得了各种不同组织来源的脱细胞基质支架材料，如小肠、皮肤、角膜、心、肺、肝、肾等。
[0006]大网膜(greater omentum)是连接胃大弯至横结肠的腹膜组织，从胃与肠之间向前膨出，在肠的前方下垂形成皱襞，呈围裙状遮被空、回肠。大网膜来源广泛，高度血管化，富含各类生长因子，目前已广泛用于各类移植物的体内移植平台。例如，其可以用于外科重建手术中对炎性或者缺损组织的修复，促进组织的血管化与再生。然而，目前大网膜脱细胞基质相关研宄刚刚起步，尚未见以大网膜脱细胞基质为支架材料，构建组织工程皮肤的相关研宄报道。
【发明内容】
[0007]根据本发明的一个方面，提供了组织工程皮肤的构建方法，包括以下步骤:
[0008](I)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及
[0009](2)组织工程皮肤构建与培养。
[0010]根据本发明的另一方面，提供了组织工程皮肤的构建方法，其特征在于，按照以下操作步骤进行:
[0011](I)制备大网膜脱细胞基质支架材料
[0012]将新鲜的大网膜组织震荡浸泡于由甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1:1: 0.2-1混合而成脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30小时，震荡频率为150-250r/min ；随后，将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于十二烷基硫酸钠/DNA酶含量由高到低的梯度脱细胞液中处理，梯度脱细胞液中十二烷基硫酸钠/DNA酶含量分别为1.5-3.5%重量比的十二烷基硫酸钠/3500-4500U/L的DNA酶、0.6-1.5%重量比的十二烷基硫酸钠/2500-3500U/L的DNA酶、0.1-0.6%重量比的十二烷基硫酸钠/1500-2500U/L的DNA酶，每梯度溶液浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min，最后，将经梯度脱细胞液处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌；以及
[0013](2)组织工程皮肤构建与培养
[0014]将5X 15-1 X 1VmL的皮肤成纤维细胞悬液l-3mL接种于步骤⑴中制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物；将所述复合构建物培养于37°C、5% CO2孵箱中1-2小时，然后添加DMEM培养液10-15mL，继续培养至第7天，随后将复合构建物进行气液面培养，每天更换一次培养液，第14-28天结束培养即可获得组织工程皮肤。
[0015]根据本发明的另一方面，提供了根据上述方法获得的组织工程皮肤。
[0016]与其他方式构建的组织工程皮肤相比，本发明中构建的组织工程皮肤以大网膜脱细胞基质为支架材料，由于大网膜脱细胞基质中富含促血管生长因子，其可促使毛细血管由创面长入移植的组织工程皮肤，从而有利于组织工程皮肤的血管化及创面愈合，对组织工程皮肤的临床应用具有重要意义。此外，本发明中支架材料来源广泛、成本低廉、操作工艺简单。
【附图说明】
[0017]图1基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤活/死(Live/Dead)染色X200。
[0018]图2基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤中VEGF表达情况(*p < 0.01)。
[0019]图3基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤中bFGF表达情况(*p < 0.01)。
[0020]图4组织工程皮肤在皮肤创面移植7天后HE染色X 200。
【具体实施方式】
[0021]在本申请中，缩写词的含义如下:
[0022]DMEM:Dulbecco' s modified eagle medium培养液，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基；
[0023]HEPEs:4_羟乙基哌嗪乙磺酸；
[0024]PBS:磷酸盐缓冲液；
[0025]SDS:十二烷基硫酸钠；
[0026]VEGF:血管外源性内皮生长因子；
[0027]bFGF:喊性成纤维细胞生长因子；
[0028]HE染色:苏木精-伊红染色；
[0029]EthD-1I1:溴化乙锭同型二聚体-1II ;
[0030]calcein AM:二乙酰甲醋
[0031]DNA酶:脱氧核糖核酸酶；
[0032]min:分钟。
[0033]根据本发明的一个方面，提供了组织工程皮肤的构建方法，包括以下步骤:
[0034](I)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及
[0035](2)组织工程皮肤构建与培养。
[0036]在某些实施方案中，在进行脱细胞处理的步骤中还进行震荡。
[0037]在某些实施方案中，步骤(I)还包括脱脂处理的步骤。
[0038]在优选的实施方案中，脱脂处理的步骤在脱细胞处理的步骤之前进行。
[0039]在优选的实施方案中，脱脂处理的步骤使用体积比为1:1: 0.2-1的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行。在某些更优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1:1: 0.4-0.7O在最优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1