一种聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于骨修复材料技术领域，具体涉及一种聚乳酸-羟基乙酸（PLGA)/腺病 毒（Ad)复合纳米纤维支架材料、制备方法及其在骨修复方面的应用。
【背景技术】
[0002] 目前治疗骨缺损的方法有组织工程科学、骨及骨替代物移植及药物治疗等方法。 其中，骨及骨替代物移植会产生创伤较大及骨整合不理想等问题，药物治疗中应用辛伐他 汀、双磷酸盐等效果并不理想。而组织工程科学可以通过支架材料、生长因子及细胞成为一 类可期待的方法。
[0003] 纳米纤维支架直径为纳米级,表面积大，因而具有独特的小尺寸效应和表面效应。 另一方面由于其类似于天然细胞外基质，有利于细胞黏附，进而促进细胞增殖及分化，而被 广泛应用。但是现阶段研究显示：体内局部细胞不足，单纯的纳米纤维支架促进骨形成的能 力有限。因此，需要生长因子或细胞与纳米纤维支架复合。外源细胞引入具有引起机体适 应性免疫反应及细胞不能成活等缺点。而促红细胞生成素（EPO)可促进内皮祖细胞（EPCs) 迁移、促进培养的人间充质干细胞（MSCs)趋化。并能通过增加间充质干细胞的趋性、迁移 性，激活基质金属蛋白酶，促进局部血管的形成，为骨再生提供良好的微环境。蛋白类生长 因子部分造价较高以及具有免疫原性，较难得到广泛应用。因此，可以应用负载生长因子基 因的载体，通过转染自体细胞原位表达相应生长因子以达到治疗目标。编码EPO基因的腺 病毒Ad-EPO能够在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。但是，单纯在骨缺损 处应用病毒不仅会使病毒随体液扩散，降低病毒浓度，还有可能造成异位感染。目前的解决 方法是利用生物材料将病毒固定于应用部位。例如：将病毒混入静电纺丝溶液中，通过高 压静电纺丝装置将病毒与纳米纤维共纺。其缺点在于高压及有机溶剂会降低病毒活力，而 且由于静电纺丝时会损失部分溶液而使病毒不易定量，进而不能控制实际应用时的病毒剂 量。这为Ad-EPO在体内应用促进骨缺损修复造成了困难。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种促进骨修复的复合纳米纤维支架材料及其制备方法 和用途。通过制备聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架与编码促红细胞生成素基因的腺病毒 (Ad-EPO)结合，达到局部提高病毒浓度，使病毒原位感染细胞，表达EP0,为骨再生提供一 个良好的微环境。但是，由于EPO并不可见，所以较难确定处理方法对腺病毒的活性是否有 损害，因此，需要一种直观的方法测定病毒活性。编码绿色荧光蛋白（EGFP)基因的腺病毒 Ad-EGFP感染细胞使细胞表达EGFP，EGFP在荧光显微镜下可发绿光，可以直观的观察病毒 的活性，同时，EGFP对细胞的增殖与分化不产生影响。因此，本发明采用Ad-EGFP在体外检 测PLGA/腺病毒复合纳米纤维支架上病毒的活力及病毒释放。利用蔗糖作为冷冻保护剂， 米用冷冻干燥法将PLGA与腺病毒复合。
[0005] 本发明所述的聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材料（PLGA/Ad)，其直 径为100~200nm，首先由静电纺丝法获得聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维，然后利用冷冻干燥 法将腺病毒固定于聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维表面。
[0006] 本发明所述的聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架的制备方法，其步骤 如下：
[0007] a)制备质量体积分数为0. 2~0. 4g/mL的聚乳酸-羟基乙酸溶液，溶剂为三氯 甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合，混合溶剂中三氯甲烷的体积含量为30~50%，然后在 20~30°C条件下磁力搅拌4~8小时直至得到透明溶液；
[0008] b)将步骤a)溶液采用高压静电纺丝装置进行纺丝，然后将纺丝产物在20~30°C 条件下真空干燥，即得到聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架材料；
[0009] c)将聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架材料裁剪成直径5mm~3cm的圆片，圆片正 反面分别进行紫外线照射消毒（功率8~10W、波长250nm~260nm，照射时间20~30分 钟）；
[0010]d)取8.55g蔗糖晶体，溶于20mL纯水中，经过带有微孔滤膜的注射滤器（0.22~ 0.45iim微孔滤膜）抽滤除菌，得到I.25M蔗糖溶液；再取浓度为2XIOltl~2X1012VPAiL 的腺病毒原体与I.25M蔗糖溶液以体积比1:4混合，得到蔗糖/腺病毒溶液；
[0011] e)取10~20UL蔗糖/腺病毒溶液滴加于步骤c)得到的聚乳酸-羟基乙酸纳 米纤维支架材料圆片的一侧表面上；在-60~_80°C下预冻20~30h，然后在-60~-80°C 的真空冷冻干燥机中冻干20~30h，获得聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架材 料。
[0012] 进一步的，所述的高压静电纺丝装置的纺丝电压为15~25kv，正负电极间的距离 为10~20cm，正极是静电纺丝装置的喷口，负极为接地的金属滚轴，正负电压使纺丝液在 喷口处的流速为0. 5mL/h~I. 5mL/h;金属滚轴的直径为10~20cm，长度为20~30cm，金 属滚轴表面覆盖锡箔纸，锡箔纸用于承接纺丝产物；喷口的直径为〇. 2~0. 4mm，所得纺丝 产物的直径范围为100~200nm。
[0013] 聚乳酸-羟基乙酸（PLGA)中，聚乳酸的质量百分含量为30~80%，优选为50%。
[0014] 本发明制备的聚乳酸-羟基乙酸/腺病毒复合纳米纤维支架主要应用于修复受损 骨组织的再生。
[0015] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0016] (1)本发明制备的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架，形貌类似于细胞外基质，利于 细胞的粘附和生长；通过控制共混比例，反应温度，时间等因素来控制材料的物理化学性能 以及降解速率，这种PLGA/Ad纳米纤维具有良好的生物相容性。
[0017] (2)制备后病毒活性保存良好，能够感染细胞表达相关蛋白。
[0018] (3)该制备方法简便可行，对设备无特殊要求并具有良好的经济效益。
【附图说明】
[0019] 图1 :实施例1制备的PLGA纳米纤维支架材料的扫描电镜图，其中PLGA的质量体 积浓度为〇. 3g/mL，图I(a)的放大倍数为10000X，图I(b)的放大倍数为5000X;
[0020] 图2 :实施例3中的PLGA/Ad-EGFP复合纳米纤维支架的病毒存留曲线；
[0021] 图3 :实施例3中的PLGA/Ad-EGFP复合纳米纤维支架感染骨髓间充质干细胞的 荧光显微镜图像。其中，AO、AUA2、A3为Ad-EGFP感染BMMSCs后1，3, 7, 14天时照射的 荧光显微镜图像；BO、Bl、B2、B3为在-70°C保存1天后的PLGA/Ad-EGFP感染BMMSCs后 1，3, 7, 14天时的荧光显微镜图像；〇)、(：1乂2、03为在-701：保存15天后的？11^/^(146?? 感染BMMSCs后1，3, 7, 14天时的荧光显微镜图像；DO、Dl、D2、D3为在-70°C保存28天后 的PLGA/Ad-EGFP感染BMMSCs后1，3, 7, 14天时的荧光显微镜图像；
[0022] 图4 :实施例3中的PLGA/Ad-EPO复合纳米纤维支架体内成骨能力检测图-- Micro-CT。其中，AUA2为对照组在第4周及第8周时的Micro-CT图像；Bl、B2为实验组 在第4周及8周时的Micro-CT图像；al、a2、bl和b2为应用IPP图像分析软件检测的Al、 A2、Bl和B2中愈合面积百分比的数据分析。*代表P< 0.05。
[0023] 图5 :实施例3中的PLGA/Ad-EPO复合纳米纤维支架体内成骨能力检测图--HE 染色。其中，AUA2为对照组在第4周及第8周时的HE染色图像；Bl、B2为实验组在第4 及8周时的HE染色图像，B3为Bl中箭头处放大10倍的图像；B4为B2中箭头处放大10倍 的图像。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1 :
[0025] 将3g的PLGA(购于sigma公司，相对分子量为3. 6万）溶于IOmL的三氯甲烷与 N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中（体积比为4 :6)，磁力搅拌4小时后，得到PLGA的三氯 甲烷与二甲基甲酰胺混合溶液；然后利用静电纺丝装置纺丝（电压为18KV，距离为14cm， 纺丝液在喷口处的流速为0. 5mL/h，金属滚轴的直径为10cm，长度为24cm，喷口的直径为 0. 3mm)，制备得到PLGA的质量体积浓度为0. 3g/mL的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架材 料，在25°C下真空干燥24h后备用。其纤维直径在IOOnm~200nm，纤维交错，表面平滑，如 图1所示。
[0026] 实施例2 :
[0027] 取8. 55g蔗糖晶体，溶于20mL纯水中，经过注射滤器（0.22 微孔滤膜）抽滤除 菌，得到1.25M蔗糖溶液。取病毒原液Ad-EGFP、Ad-EP0(美国国立卫生研究院，颅颌面研究 组，郑长玉研究员馈赠；公众亦可以得到）分别与I. 25M蔗糖溶液以I:4(V/V)混合，方法是 将2iiL浓度为2XIO12病毒颗粒（VP) /mL的Ad-EPO溶液，与8iiL浓度为I. 25M的蔗糖溶 液混合，吹打混匀后Ad-EPO浓度为4X10nVP/mL，蔗糖的终浓度为1M，此为Ad-EPO/蔗糖溶 液；取2iiL浓度为2X101(lVP/mLAd-EGFP溶液，与8iiL浓度为I. 25M的蔗糖溶液混合，吹 打混匀后Ad-EGFP浓度为4X109VP/mL，蔗糖的终浓度为1M，此为Ad-EGFP/蔗糖溶液。EGFP 是绿色荧光蛋白，EPO是促红细胞生成素，本专利中的Ad-EGFP对