含有mhc i型启动子的慢病毒载体的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于重组疫苗技术的领域并涉及慢病毒载体的改进，其可用作治疗性和预 防性疫苗。包含MHC I型（MHCI)启动子的载体提供了优于其他载体的改进的特性。
[0002] 背景
[0003] 重组疫苗已随重组DNA技术的进步而发展，允许修饰病毒基因组以产生修饰的病 毒。通过这种方式，已能够将遗传序列引入非致病性病毒，从而其编码待在感染后于靶细胞 内表达的免疫原性蛋白质，以在其宿主内发展特定免疫应答。
[0004] 此类疫苗构成了疫苗技术中的重大进步（Kutzler等，Nat Rev Genet，9 (10) :776-788, 2008)。具体而言，其具有优于传统疫苗的优势：避免活（减毒的） 病毒和消除与灭活疫苗制造相关联的风险。
[0005] 采用经修饰的逆转录病毒（逆转录病毒载体）的基因递送在上世纪80年代早 期由Mann等描述（Cell，33 (1) : 153-9, 1983)。最常用的致瘤性逆转录病毒基于莫洛尼 (Moloney)鼠白血病病毒（MLV)。其基因组简单，多聚蛋白质Gag、Pol和Env从该基因组产 生并且需要以反式形式进行病毒复制（Breckpot等，2007, Gene Ther, 14(11) :847-62 ;He 等，2007，Expert Rev vaccines, 6(6) :913-24)。一般以顺式需要的序列是长末端重复序列 (LTR)及其如下周边序列：整合所需的反向重复序列（IR或att位点）、包装序列Ψ、转运 RNA结合位点（引物结合位点，PBS)，和涉及逆转录的一些其它序列（正链起始必需的LTR 内的重复R以及多嘌呤序列（PPT))。为了生成复制缺陷型逆转录病毒载体，通常使gag、pol 和env基因全部缺失，并且用表达盒替代。
[0006] 源自慢病毒基因组的逆转录病毒载体（即慢病毒载体）已涌现为用于基因治疗和 免疫治疗目的的有希望的工具，因为它们显示优于其它病毒系统的若干优势。具体而言，慢 病毒载体本身无毒，并且不像其它逆转录病毒，慢病毒能够转导非分裂细胞，尤其是树突细 胞（He等，2007, Expert Rev vaccines, 6 (6) :913-24)，这允许通过内源性通路的抗原递呈。
[0007] 慢病毒通过遗传组成相似性、复制的分子机制和与其宿主的生物相互作用连接。 最为熟知的是其为长期亚临床感染后潜伏起始并缓慢发展的慢病综合征的病因；因此，其 被称为"慢"病毒（Narayan等，1989, J Gen Virol，70(7) : 1617-39)。其基本构成与所用逆 转录病毒相同但由于附属基因（例如'^：?、叩1'、￥口11、116；^七31：和^￥)的存在而更为复杂， 所述附属基因在慢病毒的体内复制中起关键作用。
[0008] 慢病毒代表逆转录病毒科（Retroviridae)的一个慢病毒属，其包括人免疫缺陷 病毒（HIV)、猿猴免疫缺陷病毒（SIV)、马传染性脑炎病毒（EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒 (CAEV)、牛免疫缺陷病毒（BIV)和猫免疫缺陷病毒（FIV)。慢病毒可以无限地持续存在于其 宿主内，并且在一生的感染期间以不同速度连续复制。病毒在其宿主内的持续复制取决于 其避开宿主防御的能力。
[0009] 重组整合型慢病毒载体的设计基于慢病毒的顺式与反式作用序列的分离。非 分裂细胞中的有效转导需要慢病毒基因组中存在两种顺式作用序列：中心多嘌呤序列 (cPPT)和中心终止序列（CTS)。这导致形成称为中心DNA "瓣（flap) "的三链DNA结 构，该结构使基因进入非分裂细胞（包括树突细胞（DC))核内的效率最大化（Zennou等， 2000, Cell, 101 (2) 173-85 ;Arhel 等，2007, EMBO J，26 (12) : 3025-37)。
[0010] 树突细胞对于抗原递呈而言具有重要作用，因为其构成了以递呈抗原和起始免疫 应答为主要功能的抗原递呈细胞（APC)的主要类型。
[0011] 为产生免疫应答，须由细胞将抗原蛋白加工成肽，所述肽通过主要组织相容性复 合物蛋白（MHC)在细胞表面显示。循环的APC在引流淋巴结内将肽-MHC复合物递呈至T 细胞，其在此处与T细胞受体相互作用并联合共刺激信号一起激活T细胞。
[0012] 多项研宄已显示，使用慢病毒载体的接种导致DC进行抗原呈递和抗原特异性细 胞毒性T淋巴细胞（CTL ;CD8+T细胞）的强激活。因此，在过去的10年中对慢病毒载体进 行了工程改造以用于基因转移和免疫治疗应用。
[0013] 已通过移除LTR U3序列，产生完全不含原先在LTR中存在的病毒启动子和增强子 序列的"自动失活"载体，从而改善了慢病毒载体的安全性。
[0014] 可通过重组技术，在使用不同的DNA质粒对HEK 293T人培养细胞瞬时转染后生产 含有慢病毒载体的慢病毒颗粒，所述质粒包括：
[0015] (i)包装质粒，其表达至少Gag、PolRev、Tat，并在一些情况下表达转移构建体的 包装所必需的结构和酶蛋白；
[0016] (ii)转移质粒，其含有包装、逆转录和整合所必需的表达盒和HIV顺式作用因子； 以及
[0017] (iii)编码包膜的质粒，在多数情况下是水泡性口炎病毒（VSV.G)的糖蛋白，该蛋 白允许形成能够靶向多种细胞（尤其是主要组织相容性（MHC)抗原递呈细胞（APC)，包括 DC)的混合颗粒（假型）。
[0018] 该方法能够使转染的细胞瞬时生产慢病毒颗粒载体。然而，还可通过将包装基因、 原病毒编码DNA和包膜基因稳定插入细胞基因组，使得细胞持续地生产慢病毒颗粒载体。 这允许在不需要瞬时感染的条件下由细胞持续地生产慢病毒颗粒载体。当然，也可使用这 些方法的组合，其中将一些DNA/质粒整合至细胞基因组而其他的通过瞬时转染提供。
[0019] 非整合型慢病毒载体正被设计用于降低与插入诱变事件相联系的潜在癌发生的 风险，特别用于疫苗接种目的：
[0020] 在基于直接注射抗原编码整合型慢病毒载体的疫苗接种中，表达相关抗原的转导 的细胞成为引发的免疫应答的靶标并在数天或数周内从接种疫苗的生物体中清除。
[0021] 此外，自动失活的慢病毒载体中病毒启动子和增强子序列的3' LTR的U3区域的 缺失限制了内源性启动子激活的可能性。该缺失直接体现了 1998-1999年进行的SCID-Xl 基因治疗试验所获得的经验，该试验使用基于莫罗尼病毒的逆转录病毒载体针对患有罕 见类型的X连锁（SCID-X1基因）严重免疫缺陷疾病的儿童进行（Cavazzana-Calvo等， 2000, Science.，288(5466) :669-72)。该试验期间，莫罗尼来源的逆转录病毒在非常靠 近人LM02原癌基因处的整合导致9名儿童中的4名发展了白血病（Hacein-Bey-Abina 等，2008, J. Clin. Invest.，118(9) :3132-3142)。这表明，恶性肿瘤是病毒U3启动子/增强 子接近LM02原癌基因的结果。
[0022] 增强子是顺式作用序列，其可相隔一定距离作为转录激活因子起作用。其已被广 泛用于病毒来源的载体，因为其似乎就在多种细胞类型（特别是DC)中获得转基因强表达 而言最为有效（Chinnasamy，Chinnasamy 等，2000，Hum Gene Ther 11(13) :1901-9 ;Rouas 等，2008, Cancer Gene Ther 9 (9) :715-24 ;Kimura等，2007, Mol Ther 15 (7) :1390-9 ;Gruh 等，2008, J Gene Med 10 (I) 21-32)。然而，考虑到插入诱变的安全问题，应将这类转录增强 子序列从慢病毒载体构建体中删除以破坏增强子邻近效应所产生的插入诱变风险。迄今为 止，该增强子邻近效应是最常见的插入突变机制并且是基因转移后人或动物肿瘤发生事件 的病例中描述的唯一效应。
[0023] 因此，需要研发不包括病毒增强子的逆转录病毒，特别是慢病毒载体，其允许转基 因编码的免疫原性肽足量表达，如果可能，表达量与使用CMV启动子时观察到的相当。
[0024] 一项最近的研宄报道了使用主要组织相容性复合物II型基因 （MHC II型） (Kimura 等，2007, MolTher 15(7):1390-9)和 dectin-2 基因 （Lopes 等，2008, J Virol 82(1):86-95)来源的DC特异性启动子代替病毒启动子。Lopes等使用的dectin-2基因启 动子包含推定的增强子和腺病毒保守序列（腺病毒启动子中的反向末端重复）（Bonkabara 等，2001，J. Immunology, 167:6893-6900)。Kimura等使用的MHC II型基因启动子不含任何 已知增强子。
[0025] 然而，在没有增强子的情况下，发现MHC II型启动子无法在DC中提供足够的转基 因表达。具体而言，与使用CMV启动子/增强子所观察到的免疫应答相反，包含MHC II型 启动子的慢病毒载体未能在免疫活性C57BL/6小鼠中引起免疫反应。虽然在小鼠中注射后 观察到了整合和持续的转基因表达，但通过MHC II型启动子转录的慢病毒载体无法刺激抗 原特异性⑶8+细胞毒性T淋巴细胞应答，甚至在疫苗接种加强后也是如此。这些研宄的作 者因此总结，MHC II型启动子的采用仅对于基因替代治疗中需要持续表达的应用是有兴趣 的，但在免疫治疗中并非如此。
[0026] 因此，对于针对抗原诱导免疫应答，MHC II型启动子不是适当的慢病毒载体启动 子。此外，dectin-2启动子具有树突细胞特异性，其无法消除整合至其他非表达细胞类型 中的载体。而且，dectin-2启动子似乎含有增强子。因此，由于安全原因，dectin-2启动子 不是良好的慢病毒载体启动子。
[0027] 优选地，在免疫治疗中，慢病毒载体提供了有效的转基因表达，其引发所需的特异 性免疫应答。这需要APC(如树突细胞）中的表达处于高水平。
[0028] 还优选通过免疫应答除去慢病毒载体所转导的细胞以提供更高水平的安全性。 即，针对转基因产生的免疫应答可在宿主中引发足以除去慢病毒载体转导细胞的免疫应 答。转导细胞的除去消除了宿主中慢病毒载体的持续性，以及该载体可能的次级效应。为 除去转导细胞，非树突细胞中的表达需要具有允许通过免疫应答来消除的水平。
[0029] 同时，启动子应通过原初和记忆T细胞的激活中涉及的关键细胞（即树突细胞） 使免疫刺激最大化并应使导致恶性肿瘤的干细胞中的插入诱变和基因毒性的风险最小化。 因此，启动子应在树突和其他细胞中具有足够高的活性，但不含增强子。基于这些标准，由 于强增强子的存在，病毒启动子（如CMV启动子）不是理想的。这些标准总结如下