用于针对金黄色葡萄球菌的免疫的稳定化的蛋白质的利记博彩app
【专利说明】
[0001] 本申请要求2012年8月31日提交的美国临时申请61/695, 782的权益，其全部内 容通过引用纳入本文以用于所有目的。
技术领域
[0002] 本发明涉及包含衍生自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的抗原的免疫 原性组合物及其在免疫中的用途。
【背景技术】
[0003] 金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性球菌，并且是血流、下呼吸道和皮肤以及其他 软组织感染的主要原因。其导致从轻度皮肤感染到致命性疾病（包括肺炎和败血症）的多 种疾病，且在美国每年与金黄色葡萄球菌相关的死亡率超过了任何其他感染性疾病（包括 HIV/AIDS)。
[0004] 目前没有批准的针对金黄色葡萄球菌的疫苗。在2005年的III期临床试验中，与 安慰剂组相比，基于来自5型和8型细菌的表面多糖混合物的疫苗StaphVAX?无法减少感 染。参考文献1报道了来自默克公司（Merck)和因特塞尔公司（Intercell)关于"V710" 疫苗的数据，该疫苗基于单个抗原IsdB，这是一种保守的螯合铁的细胞表面蛋白[2,3]。然 而，V710的临床试验在2011年终止，其依据是观察到V710不太可能表现出统计学上显著 的临床益处，且与安慰剂接受者相比，在疫苗接受者中出现了更高频率的涉及总体死亡率 和多器官功能障碍的安全问题[4]。
[0005] 参考文献5公开了各种金黄色葡萄球菌抗原及其组合，包括用作疫苗策略的 "(：〇11113〇-1"出8叉六48叉8、突变型!11&、5七&006和5七&011的混合物）和"(：〇11113〇-2"伍8叉六48叉8、 IsdA、Sta006和StaOll的混合物）。参考文献6公开了金黄色葡萄球菌多肽抗原在简单的 缓冲溶液中可能不稳定并可通过加入稳定化添加剂（如EDTA)来稳定该抗原。抗原的不稳 定是不希望的，因为（1)这使得疫苗不能在给药之前长时间储存，和（2)疫苗批次之间的不 一致会影响品质和监管审批的要求。此外，含有这些不稳定抗原的疫苗的生产会变得复杂 且涉及多个纯化步骤。因此，本发明的一个目标是鉴定使免疫原性组合物中的金黄色葡萄 球菌多肽抗原稳定的其他策略。
【发明内容】
[0006] 发明人发现，避免抗原的寡聚化是提高抗原稳定性的有效策略。多种金黄色葡萄 球菌抗原含有半胱氨酸残基，且它们可在标准缓冲溶液中形成寡聚体，包括由半胱氨酸残 基之间的二硫键形成的共价二聚体。发明人发现，含有这些共价二聚体的组合物可能是不 稳定的，并且可形成聚集体或影响组合物中其他抗原（如果存在）的稳定性。可通过取 代、修饰或去除半胱氨酸残基从而使二硫键无法形成的方式防止共价二聚体的形成。有趣 的是，防止这些抗原形成共价二聚体提高了抗原稳定性并维持了组合物的高度总体选择性 (即相对于总体抗原存在高比例的单一同种型）和纯度。此外，发明人发现，这些半胱氨酸 缺陷型抗原在引发针对野生型含半胱氨酸抗原的免疫应答上仍然有效。因此，可在免疫组 合物中包含半胱氨酸缺陷型抗原以提高抗原稳定性。
[0007] Sta006和StaO 11抗原的成熟形式中天然具有N-末端半胱氨酸。EsxB蛋白天然含 有内部半胱氨酸残基。发明人发现野生型含半胱氨酸的Sta006、Sta011、Hla和EsxAB的组 合在水性条件下没有良好的长期稳定性。野生型含半胱氨酸的Es XAB、Sta006和StaOll可 在缓冲溶液中发生氧化还原反应并且形成不稳定的同二聚体或异二聚体（例如，Sta006/ StaOll等）。这些二聚体可因半胱氨酸残基之间形成二硫键而产生。发明人发现二硫键形 成的消除（例如，通过取代、修饰或删除半胱氨酸残基）使抗原之间以及抗原与其他组分之 间的干扰最小化。因此，包含在还原条件下不含任何游离巯基的EsxAB、Sta006和StaOll 的变体（因而不形成同二聚体或异二聚体）的免疫原性组合物比含有含半胱氨酸残基（即 在还原条件下含游离巯基）的野生型抗原更稳定。发明人发现含有不含巯基的抗原变体的 免疫原性组合物能在液体制剂中稳定至少4周。这种免疫原性组合物也显示具有更高的选 择性、再现性、稳定性、纯度和改善的加工特点。因此，可以较少的纯化步骤生产本发明的免 疫原性组合物。因此，生产过程更为简单和高效。
[0008] 因此，本发明提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：（i)EsxB抗 原，例如，具有与SEQ ID N0:16有至少90% (例如，彡91%、彡92%、彡93%、彡94%、 彡95 %、彡96 %、彡97 %、彡98 % )相同性的氨基酸序列的多肽；（ii) Sta006抗原，例如，具 有与SEQ ID NO :24有至少90% (例如，彡91%、彡92%、彡93%、彡94%、彡95%、彡96%、 彡97%、彡98%、彡99%、彡99. 5% )相同性的氨基酸序列的多肽；和/或（iii) StaOll 抗原，例如，具有与SEQ ID NO :28有至少90% (例如，彡91%、彡92%、彡93%、彡94%、 彡95%、彡96%、彡97%、彡98%、彡99%、彡99. 5% )相同性的氨基酸序列的多肽，前提 是这些抗原都不含任何游离巯基，并且多肽（i)至（iii)各自可引发（例如，当给予人时） 识别相应的野生型含半胱氨酸的抗原的抗体。例如，（i)可引发识别SEQ ID NO :2(EsxB) 的抗体，（ii)可引发识别SEQ ID N0:10(Sta006)的抗体，并且（iii)可引发识别SEQ ID NO : 11 (StaOll)的抗体。
[0009] 该免疫原性组合物还可包含Hla (优选无毒形式，例如下文所述的Hla-H35L)。因 此，该免疫原性组合物优选还包含：（iv) Hla的H35L突变体形式，例如包含SEQ ID NO :9,其 可引发识别SEQ ID NO :67(野生型Hla)的抗体。
[0010] 如下文所述，EsxB抗原可与EsxA组合成杂交多肽，例如，具有EsxA抗原下游的 EsxB抗原的EsxAB杂合体。这些抗原在参考文献5中有详细描述。
[0011] 因此，本发明的有用的组合物包括：（i)含氨基酸序列SEQ ID NO :59的第一多肽 (EsxAB) ; (ii)含氨基酸序列SEQ ID NO :26的第二多肽（Sta006);和/或（iii)含氨基酸 序列SEQ ID NO :32的第三多肽（StaOll);并且任选地还包括（iv)含氨基酸序列SEQ ID NO :9的第四多肽（Hla-H35L)。
[0012] 在一些实施方式中，所述组合物可包含一种或多种其它多肽；在其它实施方式中， 所述组合物中的仅有多肽是上述的那些。如果所述组合物包含一种或多种其他多肽，优选 这些多肽不含任何游离巯基。
[0013] 在本发明的一些实施方式中，该免疫原性组合物包含其它抗原，该抗原可以是多 肽和/或糖。例如，其还可包括一种或多种金黄色葡萄球菌荚膜糖偶联物，例如针对血清型 5和/或血清型8菌株。在其他实施方式中，该组合物不包括其他葡萄球菌多肽抗原。在其 他实施方式中，该组合物不包括其他葡萄球菌抗原。在另一个实施方式中，该组合物不包括 其他抗原。
[0014] 当存在超过一种多肽时，它们可以基本相等的质量存在，即，其各自的质量在全部 多肽平均质量的±5%以内。因此，当存在四种多肽时，它们可以a : b : c : d的质量比 存在，其中a-d各自在0.95和1.05之间。
[0015] 本发明还提供了本发明的免疫原性组合物的冻干物。该冻干物可使用水性物质重 建以提供水性的本发明的免疫原性组合物。为进行给药，使用合适的液体稀释剂（例如缓 冲液、盐水溶液、用于注射的水（WFI))重建冻干物。所述液体稀释剂可包括佐剂，例如铝盐 或水包油乳液佐剂。
[0016] 本发明的组合物可以是水性形式，此时理想情况下其pH为5至8。所述组合物还 可包括佐剂，例如铝盐。
[0017] 金黄色葡萄球菌抗原
[0018] EsxA
[0019] "EsxA"抗原作为有用的免疫原公开于参考文献5中。其原始仅被标注为"蛋白 质"。在NCTC 8325菌株中，EsxA是SA0UHSC_00257且具有氨基酸序列SEQ ID NO :1 (GI : 88194063)。SEQ ID NO :1没有半胱氨酸残基并且不含游离巯基。本发明所用的EsxA也应 该不含游离巯基。适用于本发明的各种形式的EsxA抗原见述于参考文献5。有用的EsxA 抗原能够引发识别野生型EsxA抗原（例如SEQ ID NO: 1)的抗体（例如在给予人时）。多 肽可包括如下氨基酸序列：（a)与SEQ ID NO :1有80%或更高相同性（例如，85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99·5%或更高） ；且/或（b)包括SEQ ID NO: 1的至少"η"个连续氨基酸的片段，其中"η"是7或更多（例如，8、10、12、14、16、18、 20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或更多）。这些EsxA蛋白包括SEQIDN0 :l的变体。（b) 的优选片段包含来自SEQ ID NO :1的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO :1的C末端的一 个或多个（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个）氨基酸和/或N末端的一个或 多个（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个）氨基酸，而保留SEQ ID NO :1的至 少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。
[0020] EsxA可以与下文所述的EsxB的杂交多肽的形式存在。
[0021] EsxB
[0022] "EsxB"抗原作为有用的免疫原公开于参考文献5中。在NCTC 8325菌株中，其为 SA0UHSC_00265且具有氨基酸序列SEQ ID NO :2(GI :88194070)。本发明使用不能通过二 硫键形成共价二聚体的EsxB形式。该多肽不含任何游离的巯基（在还原条件下）。其能 够引发识别野生型EsxB抗原（例如SEQ ID NO :2)的抗体（例如在给予人时）。该多肽可 包含与SEQIDN0:16、19、20、21、22、23、43、44或45中任一条序列具有80%或更高（例如 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高）相同性的 氨基酸序列。其也可包含与SEQ ID勵：15、17、18、42、46或47中任一条序列具有80%或更 高（例如 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高） 相同性的上游氨基酸序列。
[0023] SEQ I