用于治疗各种疾病和病症的抑制masp-1和/或masp-2和/或masp-3的组合物和方法
【专利说明】用于治疗各种疾病和病症的抑制MASP-1和/或MASP-2和 /或MASP-3的组合物和方法
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[0003] 背景 补体系统为在人和其它脊椎动物中启动、放大和安排针对微生物感染和其它急性 损伤的免疫应答提供了早期的作用机制（M.K. Liszewski和J.P. Atkinson，1993， 散子 Fundamental Lmunology,第 3 版，W. Ε· Paul 编辑，Raven Press, Ltd.， New York)。尽管补体活化提供了重要的针对潜在病原体的第一道防线，但是促进 保护性免疫应答的补体活性也可以表现出对宿主的潜在威胁（K.R. Kalli等人， Springer Semin. ImmunopathoL 75":417-431, 1994 ；B. P. Morgan, Eur. J. Clinical 219-228，1994)。例如，C3和C5蛋白水解产物募集并活化嗜中性粒细胞。尽 管对于宿主防御是必不可少的，但是活化的嗜中性粒细胞在它们破坏性酶的释放中是不加 选择的，并可以导致器官损伤。此外，补体活化可以导致溶胞的补体成分沉积在附近的宿主 细胞以及微生物靶上，导致宿主细胞裂解。
[0004] 补体系统也与许多急性和慢性疾病状态的发病机制有牵连，所述疾病包括：心肌 梗塞、中风、ARDS、再灌注损伤、败血性休克、热烧伤之后的毛细血管渗漏、心肺分流术后炎 症、移植排斥、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力和阿尔茨海默病。在几乎所有的这 些病况中，补体都不是病因，而是发病机制所涉及的若干因素之一。尽管如此，补体活化可 以是重要的病理机制，并对许多这类疾病状态中的临床控制表现出有效之处。对各种疾病 状态中补体介导的组织损伤的重要性的逐渐增加的认识强调了对有效补体抑制药物的需 求。迄今为止，Eculizumab (Solaris?)，一种针对C5的抗体，是仅有的已被批准人用的补 体靶向药物。然而，C5是位于补体系统"下游"的几个效应物分子之一，并且对C5的阻断并 不抑制补体系统的活化。因此，补体活化的起始步骤的抑制剂将具有相对"下游"补体抑制 剂的显著优势。
[0005] 目前，普遍接受的是补体系统可通过三种截然不同的途径被活化：经典途径、凝集 素途径和替代途径。经典途径通常是由宿主抗体结合外源颗粒（即抗原）组成的复合物而 触发，并且因此需要预先暴露于抗原以产生特异性抗体应答。因为经典途径的活化取决于 宿主先前的获得性免疫应答，所以经典途径是获得性免疫系统的一部分。相反，凝集素途径 和替代途径两者不依赖于获得性免疫，并且是先天性免疫系统的一部分。
[0006] 补体系统的活化导致丝氨酸蛋白酶酶原（zymogen)的连续活化。经典途径活化的 第一步是特异性识别分子Clq与结合了抗原的IgG和IgM分子的结合。Clq与Clr和Cls 丝氨酸蛋白酶酶原结合成称为Cl的复合物。当Clq与免疫复合物结合时，Clr的Arg-Ile 位点进行自我蛋白水解切割，随后是Clr介导的Cls切割和活化，其从而获得切割C4和C2 的能力。C4被切割成两个片段，称为C4a和C4b，并且，类似地，C2被切割成C2a和C2b。C4b 片段能够与邻近的羟基或氨基形成共价键，并且通过与活化C2的C2a片段进行非共价相互 作用而生成C3转化酶（C4b2b)。C3转化酶（C4b2b)通过蛋白水解切割成C3a和C3b亚成 分而活化C3,导致C5转化酶（C4b2a3b)的生成，其通过切割C5导致可以破坏细胞膜导致细 胞裂解的膜攻击复合物（结合C6、C7、C8和C9的C5b，也称为"MAC"）的形成。C3和C4的 活化形式（C3b和C4b)共价沉积在外源靶表面上，其被多种吞噬细胞上的补体受体所识别。
[0007] 独立地，补体系统通过凝集素途径活化的第一步也是特异性识别分子的结合，其 随后是所结合的丝氨酸蛋白酶酶原的活化。然而，凝集素途径中的识别分子包括一组统称 为凝集素的糖结合蛋白（甘露聚糖结合凝集素（MBL)、H-纤维胶凝蛋白（H-ficolin)、M-纤 维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和C型凝集素 CL-11)，而不是通过Clq来结合免疫复合物。参 见 J. Lu 等人，Jcia7?57J?:387-400, (2〇〇2) ;Holmskov 等人， Tfer. J遞《//?〇人 21:547-578 (2003) ;Teh 等人，J遞《//?〇7〇灯7似:225-232 (2000))。另见 J. Luet 等人，Jcia 1572:387-400 (2002) ;Holmskov 等人，JzwwTfeF J遞21:547-578 (2003) ;Teh 等人，J遞《//?〇7〇灯 101:225-232 (2000) ;Hansen 等人， 7； J蕭仙〇7 185(10) :6096-6104 (2010)。
[0008] Ikeda等人首先证明，与Clq类似，MBL在与酵母甘露聚糖-包被的红细胞结合 后可以以依赖C4的方式使补体系统活化（Ikeda等人，J沿·〇/.泛挪.似:7451-7454， (1987))。MBL是胶原凝集素蛋白家族的成员，是钙依赖性凝集素，其与具有定向于吡喃糖 环赤道面上的3-羟基和4-羟基的碳水化合物结合。因此MBL的重要配体是D-甘露糖和 N-乙酰-D-葡糖胺，而不符合这种空间要求的碳水化合物则对MBL没有可检测的亲和性 (Weis等人，yVatore 360:127-134，（1992)) oMBL和单价糖之间的相互作用是相当微弱的， 解离常数通常在个位数毫摩尔的范围内。MBL通过亲合力，即通过同时与位置彼此靠近的多 个单糖残基相互作用来实现对聚糖配体特异性地紧密结合（Lee等人，ArcAiK AiocAim 沒299:129-136，（1992))。MBL识别通常修饰微生物如细菌、酵母、寄生虫和某些 病毒的碳水化合物模式。相反，MBL不识别D-半乳糖和唾液酸，即倒数第二位和倒数第一 位的糖，它们一般修饰哺乳动物血浆和细胞表面糖蛋白上存在的"成熟"复合糖缀合物。认 为这种结合特异性促进"外源"表面的识别和有助于保护免于"自身活化"。然而，MBL确实 以高亲和性结合高甘露糖"前体"聚糖簇，这些簇位于被隔离在哺乳动物细胞的内质网和高 尔基体内的N-连接的糖蛋白和糖脂上（Maynard等人，J泛挪.激7:3788-3794， (1982))。另外，已经证实MBL可以结合可暴露在坏死的和凋亡的细胞上的多核苷酸、DNA和 RNA (Palaniyar 等人，Λ Z JcatZ 5bi·, 1010:467-470 (2003) ;Nakamura 等人， 7； ZeA沿W. 86:737-748 (2009))。因此，受损细胞是经由MBL结合的凝集素途径活化 的潜在目标。
[0009] 纤维胶凝蛋白具有与MBL不同类型的凝集素结构域，称为纤维蛋白原-样结构域。 纤维胶凝蛋白以不依赖Ca++的方式来结合糖残基。在人中，已经鉴定出三种类型的纤维胶 凝蛋白（L-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白）。L-纤维胶凝蛋白和H-纤 维胶凝蛋白这两种血清纤维胶凝蛋白共同对N-乙酰-D-葡糖胺具有特异性；然而，H-纤维 胶凝蛋白还结合N-乙酰-D-半乳糖胺。L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白、CL-II和MBL的 糖特异性的差异意味着不同的凝集素可以是互补的，尽管有重叠，但是可靶向不同的糖缀 合物。这个观点得到了最近报道的支持，即在凝集素途径的已知凝集素中，只有L-纤维胶 凝蛋白与脂磷壁酸特异性结合，所述脂磷壁酸是在所有革兰氏阳性菌上发现的一种细胞壁 糖缀合物（Lynch等人，J J遞《wo/. 7721198-1202，（2004))。除了乙酰化糖部分外，纤 维胶凝蛋白还可结合乙酰化氨基酸和多肽（Thomsen等人，#〇/. J遞48(4):369-81 (2011))。胶原凝集素（即MBL)和纤维胶凝蛋白在氨基酸序列上没有显著的相似性。然而， 这两组蛋白质具有类似的结构域组构，且与Clq类似，装配成寡聚结构，这样就使得多位点 结合的可能性最大化。
[0010] MBL的血清浓度在健康人群中是高度可变的，这在遗传上是由MBL基因的启动子 和编码区二者的多态性/突变所控制。作为急性期蛋白，MBL的表达在炎症期间进一步上 调。L-纤维胶凝蛋白在血清中存在的浓度与MBL的浓度类似。因此，凝集素途径的L-纤维胶 凝蛋白分支在强度上可能与MBL分支不相上下。MBL和纤维胶凝蛋白还可能作为调理素起 作用，其允许吞噬细胞祀向MBL-和纤维胶凝蛋白-修饰的表面（参见Jack等人，/Zedoc 77(3):328-36 (2004)，Matsushita和Fujita, J遞《//?〇办205(4_5):490_7 (2002) ，Aoyagi等人，/J遞174(1) :418-25(2005))。此调理素作用需要这些蛋白 与吞噬细胞受体相互作用0〇止111^11等人，7；/^/7.#(9￡/.7你:1733，（1989);]\^丨811811；^3 等人，7；沿·〇/.泛￡皿277:2448-54，（1996))，这些吞噬细胞受体的身份还未得到确定。
[0011] 人MBL通过其胶原-样结构域与独特的Clr/Cls-样丝氨酸蛋白酶（称为MBL相 关的丝氨酸蛋白酶（MASP))形成特异性和高亲和性的相互作用。迄今为止已经描述了三 种MASP。首先，鉴定出单一的酶"MASP"，并且其特征是作为负责启动补体级联（即切割 C2 和 C4)的酶（Matsushita 等人，/五切 ifei/ 176(6):1497-1502 (1992) Ji 等人，7； Immunol. 7^:571-578, (1993))。随后，确定MASP活性实际上是两种蛋白酶MASP-I和 MASP-2 的混合物（Thiel 等人，J浙:506-510，（1997))。然而，证明 MBL-MASP-2 复 合物单独就足以使补体活化（Vorup-Jensen等人，J J遞7你:2093-2100，（2000))。 此外，只有 MASP-2 以高速切割 C2 和 C4 (Ambrus 等人，7； J遞77Λ 1374-1382， (2003) )。因此，MASP-2是负责活化C4和C2以产生C3转化酶C4b2a的蛋白酶。这是不同 于经典途径中Cl复合物的显著差异，在经典途径中两种特异性丝氨酸蛋白酶（Clr和Cls) 协同作用导致了补体系统的活化。另外，已经分离出第三种新的蛋白酶MASP-3 (Dahl， M. R.等人，J遞75": 127-35，2001)。MASP-I和MASP-3是同一基因的可变剪接产物。
[0012] MASP与Cl复合物的酶成分Clr和Cls共享相同的结构域组构（Sim等人， 沒iocAe?. 5bc. 忽:545，（2000))。这些结构域包括 N-末端 Clr/Cls/海胆 VEGF/ 骨形成蛋白（CUB)结构域、表皮生长因子-样结构域、第二CUB结构域、串联的补体调控蛋 白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。与在Cl蛋白酶中一样，MASP-2的活化通过丝氨酸蛋白 酶结构域附近的Arg-IIe键裂解而发生，其将酶分成二硫键连接的A链和B链，后者由丝氨 酸蛋白酶结构域构成。
[0013] MBL还与MASP-2的可变剪接形式，称为19 kDa MBL相关蛋白（MApl9)或者 小MBL相关蛋白（sMAP)缔合，所述蛋白缺乏MASP-2的催化活性（Stover, J J遞 7似：3481-90, (1999) ;Takahashi 等人，J遞κ//?ο7· 77:859-863，（1999))。ΜΑρ19 包括MASP-2的前两个结构域，其后接4个独特氨基酸的额外序列。Mpl9的功能尚不清楚 (Degn等人，/ J遞《//?〇乂 ifeiAoife, 2011)。MASP-I基因和MASP-2基因分别位于人的3号 和 1 号染色体上（Schwaeble 等人，Imiunobiology 205\A5b-A&^>, (2002))。
[0014] 若干证据表明存在不同的MBL-MASP复合物，且血清中大部分MASP不与MBL复 合（Thiel等人，J J遞7^^:878-887，（2000))。H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝 蛋白都与所有MASP结合，并且活化凝集素补体途径，如MBL所为（Dahl等人，J遞 75:127-35, (2001) ;Matsushita 等人，7； J遞κ//?ο7. 7你:3502-3506, (2002))。凝集素 途径和经典途径都形成共同的C3转化酶（C4b2a)，并且这两条途径在这一步会合。
[0015] 普遍认为凝集素途径在首次用于实验的（na'ive)宿主中的宿主抵抗感染的防御 中具有重要作用。MBL参与宿主防御的强有力证据来自于对功能性MBL血清水平降低的患 者的分析（Kilpatrick, 401-413，（2002))。这些患者表现 出对复发性细菌和真菌感染的易感性。在易损性的表观窗期间，这些症状通常在生命早期 是明显的，因为从母体获得的抗体效价降低，但处于完整的抗体应答谱（repertoire)发育 之前。这种综合征经常是由于MBL胶原部分的数个位点突变引起的，其干扰了 MBL寡聚体 的正确形成。然而，由于MBL可以作为不依赖于补体的调理素起作用，所以还不知道对感染 的易感性增加的多大程度是由于受损的补体活化所致。
[0016] 与经典途径和凝集素途径相反，没有发现替代途径中完成识别功能的引发剂，而 在其它两种途径中是Clq和凝集素来完成识别功能的。目前普遍接受的是，替代途径自发 经历低水平的周转活化（turnover activation),其可以容易地在外来表面或其它异常表 面（细菌、酵母、病毒感染的细胞或者受损组织）上放大，所述表面缺少保持受控的自发补 体活化的适当分子元件。有四种血浆蛋白直接参与了替代途径的活化：C3、因子B、因子D和 备解素。
[0017] 尽管大量证据表明经典补体途径和替代补体途径两者都涉及非感染性人类疾病 的发病机制，但是对凝集素途径作用的评价才刚刚开始。最近研究提供的证据表明，凝集 素途径的活化可能是在缺血/再灌注损伤中补体活化和相关炎症的原因。Collard等人 (2000) 报告受到氧化应激的培养的内皮细胞结合MBL，且在暴露于人血清时显示出C3沉 积（Collard 等人，如.7； PaiAo乂 7你:1549-1556，（2000))。此外，用封闭性抗 MBL 单 克隆抗体处理人血清抑制了 MBL结合和补体活化。将这些发现扩展到心肌缺血-再灌注 大鼠模型上，其中比起用对照抗体处理的大鼠，用针对大鼠 MBL的封闭性抗体处理的大鼠 在冠状动脉闭塞时显示心肌损伤显著较轻（Jordan等人，CYrcWaiio/? 76^:1413-1418， (2001) )。尚不清楚氧化应激后MBL与血管内皮结合的分子机制；最近的研究表明，氧化应 激后凝集素途径的活化可能是由MBL与血管内皮细胞角蛋白结合而介导，而不是与糖缀合 物结合而介导（Collard等人，J?. J 75?1045-1054，（2001))。其它研究已表 明缺血/再灌注损伤的发病机制中的经典途径和替代途径以及凝集素途径在这种疾病中 的作用仍然存在争议（Riedermann, N. C.等人，办?. 7； PaiAo/. 7似:363-367, 2003)。
[0018] 近期的研究显示，MASP-I和MASP-3将替代途径活化酶因子D从其酶原形式转化 成其酶活性形式（参见 Takahashi M.等人，/ ifei/ 207(1) :29-37 (2010) ; Iwaki 等 人，J. Immunol. 187:3751-58 (2011))。此过程的生理重要性通过在MASP-1/3-缺陷小 鼠的血浆中不存在替代途径功能活性而得以强调。对于替代途径，需要由天然C3蛋白水解 生成的C3b发挥作用。由于替代途径C3转化酶（C3bBb)含有C3b作为必需亚基，因此关于 经由替代途径的第一个C3b来源的疑问已提出了令人困扰的问题，且促使了相当多的研究 工作。
[0019] C3属于含有被称为硫酯键的极少的翻译后修饰的蛋白质家族（与C4和α -2巨球 蛋白一起）。硫酯基团由谷氨酰胺组成，其末端羰基与距离三个氨基酸外的半胱氨酸的巯基 形成共价硫酯连接。该键不稳定，且亲电子的谷氨酰-硫酯可与亲核部分例如羟基或氨基 反应并从而与其它分子形成共价键。当被隔离在完整C3的疏水口袋内部时，硫酯键是相当 稳定的。然而，C3被蛋白水解切割成C3a和C3b，导致C3b上高反应性的硫酯键暴露出来， 并随着通过包括羟基或氨基的邻近部分的亲核攻击，C3b与靶共价结合。除了充分记载的 其在C3b与补体靶共价结合中的作用外，还认为C3硫酯具有触发替代途径的关键作用。根 据普遍接受的"tick-over理论"，替代途径由液相转化酶iC3Bb的生成所启动，iC3Bb由C3 与水解的硫酯（iC3;C3 (H2O))和因子 B 形成（Lachmann, P.J.等人， J遞7:143-162，（1984))。C3b_样C3 (H2O)由天然C3经蛋白质中内部硫酯的 缓慢自发水解而产生（Pangburn，M.K·，等人，J ifei/· 856-867，1981)。通过 C3 (H2O)Bb转化酶的活性，C3b分子沉积在靶表面，从而启动替代途径。
[0020] 在本文所述的发现之前，对替代途径活化的引发剂的了解甚少。认为活化剂包括 酵母细胞壁（酵母聚糖）、许多纯的多糖、兔红细胞、某些免疫球蛋白、病毒、真菌、细菌、动 物肿瘤细胞、寄生虫和受损细胞。这些活化剂所共有的唯一特征是碳水化合物的存在，但是 碳水化合物结构的复杂性和多样性使得难以确定被识别的共享分子决定子。广泛接受的是 替代途径活化通过此途径的抑制性调节成分之间的精细平衡控制，所述成分例如因子H、因 子I、DAF和CR 1和备解素，后者是替代途径唯一的阳性调节因子（参见Schwaeble W.J.和 Reid K. B. , Immunol Today 20 (I) : 17-21 (1999)) 〇
[0021] 除了上文所述的明显的未调节的活化机制，替代途径还可以为凝集素/经典途径 C3转化酶（C4b2a)提供强力的放大环，因为任何生成的C3b都可以与因子B参与形成额外 的替代途径C3转化酶（C3bBb)。替代途径C3转化酶通过结合备解素被稳定化。备解素使 替代途径C3转化酶的半衰期延长六到十倍。向替代途径C3转化酶添加 C3b导致替代途径 C5转化酶的形成。
[0022] -直以来认为所有三种途径（即经典、凝集素和替代途径）会合于C5,它被切割 形成具有多种促炎作用的产物。会合的途径被称为末端补体途径。C5a是最有效的过敏毒 素，引起平滑肌和血管紧张度以及血管通透性的改变。它还是嗜中性粒细胞和单核细胞两 者的强有力的趋化因子和活化因子。C5a介导的细胞活化能够通过诱导释放多种另外的炎 症介质来显著放大炎症反应，另外的炎症介质包括细胞因子、水解酶、花生四烯酸代谢物和 活性氧类。C5裂解导致了 C5b-9的形成，它也被称为膜攻击复合物（MAC)。目前强有力的 证据表明，亚裂解的MAC沉积除了起到作为裂解的孔-形成复合物的作用外，还可能还在炎 症中发挥重要作用。
[0023] 除了其在免疫防御中的重要作用之外，补体系统还在很多临床病况中导致组织损 伤。因此，对开发治