一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物细胞培养和化妆品领域，具体涉及一种植物细胞培养法，通过剪 碎代替打浆减少对细胞的损失，采用果胶酶和纤维素酶联合消化缩短消化时间的改进，来 获得莲叶细胞的次生代谢物，制作成冻干粉，作为抗衰老化妆品。
【背景技术】
[0002] 莲叶为睡莲科植物莲，又名荷叶，藕叶。《本草纲目》记载，"荷叶服之令人瘦劣。单 服可以消阳水浮之气。能生发元气，裨助脾胃，涩精浊，散癖血，消肿痛，发痘疮。莲叶中化 学成分主要为黄酮类化合物和莲叶碱，二者具有较高的生物活性，其中的黄酮类化合物作 为一种过氧化自由基的清除剂，能有效防止脂质过氧化反应对生物机体组织损伤，这种损 伤导致许多疾病的发生和组织的衰老。而随着年龄的增长，机体内清除自由基的能力逐渐 下降，通过向机体组织添加这种自由基清除剂可以达到到抵延缓衰老的目的。目前莲叶中 的化学成分提取及药用价值研宄颇多，而很少将其抗衰老作用应用于化妆品中。
[0003] 目前莲叶中的黄酮类化合物均用化学提取法，主要步骤：莲叶清洗干净后烘干，粉 碎，置于70-80 %的乙醇中回流提取，将提取液浓缩至原体积1/3,过滤得到初提液，将初提 液用大孔树脂吸附，然后经过洗脱，抽滤，浓缩，萃取，静置，过滤，干燥的步骤后，得到成品。 而植物细胞培养法目前并没有应用于莲叶，该方法主要步骤（以人参为例）：将人参浸泡 在10%次氯酸钠中20分钟进行灭菌，然后用无菌水洗人参至次氯化钠无残留，将洁净后的 人参放入打浆机加入MS培养基，打浆。打浆液加入纤维素酶100mg/kg，放置3-5小时，用 50-80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液用低速离心机分离，去除上清液和杂志，莲叶细胞转 移至改良MS培养基中，调pH 5-6,90-120r/min搅拌，避光培养，获得大量人参细胞培养液。 化学提取法要经过预处理，初提，大孔吸附树脂分离，有机溶剂纯化，后处理五个环节，生产 工艺复杂；同时其安全性低，生产过程中使用大量有机溶剂，极易残留在成品中，不利于身 体健康；会造成环境污染，生产过程中会对环境中排放大量有机溶剂；受限于莲叶的生长 季节，影响成品的产量。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了全新的莲叶细胞培养法，替代化 学提取法，通过纤维素酶和果胶酶的联合作用，减少了细胞的培养时间，简化了生产工艺， 同时产品安全性高还可长期稳定生产；运用于化妆品中具有抗衰老的作用。
[0005] 本发明通过以下技术方案来实现：
[0006] -种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
[0007] (1)获取莲叶细胞株：在每0· 5g_3. Og无菌莲叶中加入5_30mlMurashige and Skoog培养基及0. 025-0. 30ml质量分数为0. 2-0. 3 %纤维素酶溶液和0. 025-0. 30ml质量 分数为0. 2-0. 3%果胶酶溶液进行消化；将消化后所得消化液过滤、离心除去上清液后得 到莲叶细胞株；
[0008] (2)大量培养莲叶细胞：
[0009] 1)初步培养：采用I号灭菌培养基将莲叶细胞株配制成（0. 5-5) X IO4个/ml密 度的莲叶细胞液，将所述莲叶细胞液置于旋转式摇床上，在24-27°C的环境下和转速为 15〇-180rpm/min的条件下培养；
[0010] 2)悬浮培养：将经过初步培养后的莲叶细胞培养液去除上清液，采用II号灭菌培 养基将莲叶细胞配制成（0. 5-5) X IO5个/ml密度的莲叶细胞液并置于发酵罐中，通入速率 为0. 01-0. 05m3/s的过滤空气，在24-27°C的环境下和转速为120-150rpm/min的条件下进 行悬浮培养得到莲叶细胞培养物；
[0011] (3)制备莲叶细胞次生代谢物冻干粉：收集莲叶细胞培养物对其过滤、浓缩和冻 干处理后得到莲叶细胞次生代谢物冻干粉。
[0012] 优选的，步骤（1)中选取新鲜莲叶进行消毒。
[0013] 优选的，步骤（1)中将莲叶在质量分数为15% -20%的次氯酸钠溶液中消毒，消毒 后采用无菌去离子水清洗。
[0014] 优选的，步骤（1)中所述无菌莲叶在加入Murashige and Skoog培养基前为碎片， 且碎片面积大小< Imm2;所述纤维素酶溶液与果胶酶溶液体积为1:1。
[0015] 优选的，步骤（1)中采用200目无菌网筛对消化液进行过滤，将过滤液加入到 Countstar细胞计数器中，过滤液再250g的离心力下离心10min。
[0016] 优选的，步骤（2)中初步培养时每100mL莲叶细胞液培养14天。
[0017] 优选的，步骤（3)所述莲叶细胞培养物采用孔径小于0. 45 μ M的滤膜过滤；浓缩上 清液至浓缩液中蛋白浓度为50±0. 5 μ g/ml ;浓缩上清液采用孔径小于0. 22 μM的滤膜过 滤。所述冻干处理时冻干温度为（_20°C )-(_35°C )，真空度为50-200Pa，冻干时间为24-36 小时，即得到莲叶细胞次生代谢物冻干粉。
[0018] 本发明所述的莲叶细胞次生代谢物冻干粉在抗衰老护肤品中应用。
[0019] 所述抗衰老扶护品为面膜、爽肤水、面霜、乳液、眼霜、洗面乳。
[0020] 所述莲叶细胞次生代谢物冻干粉在抗衰老扶护品中的添加量为300-800 μ g/ml。
[0021] 本发明采用植物细胞培养法，通过剪碎代替打浆减少对细胞的损失，采用果胶酶 和纤维素酶联合消化缩短消化时间的改进，来获得莲叶细胞的次生代谢物，制作成冻干粉， 作为抗衰老化妆品。
[0022] 有益效果：
[0023] 1.简化生产工艺，提供工作效率。将对原料进行预处理、初提、大孔吸附树脂分离、 有机溶剂纯化和后处理的五个环节简化了获取细胞株、细胞培养和细胞培养物收集冻干的 三个环节，大大简化生产步骤。
[0024] 2.提高了莲叶细胞培养效率和质量。通过使用果胶酶和纤维素酶联合消化，缩短 细胞培养时间，同时使用剪刀代替搅拌机对莲叶进行分解，提高原始莲叶细胞株的质量，减 少莲叶细胞株的损伤。
[0025] 3.产品生产量不受限于原材料的生产地区和季节，可长期稳定生产。
[0026] 4.产品安全性高。培养全过程为无菌操作，也不使用有机溶剂，冻干粉中不会残留 任何化学物质和病菌。
[0027] 5、产品具有抗衰老效果。收集莲叶细胞培养液并进行冻干制备，有效保存莲叶细 胞的次生代谢物中的黄酮成分，改冻干粉可