分子伴侣/引领蛋白融合蛋白的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含具有外源生物活性序列之重组蛋白质单体的蛋白质聚合物。更特 别地，本发明涉及包含至少一种分子伴侣/引领蛋白（chaperone/usher)家族多肽单体的 分子伴侣/引领蛋白家族聚合物，其中所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体包 含外源生物活性序列。
【背景技术】
[0002] 体内蛋白质和其他胞外基质（ECM)组分形成了互连的网孔（mesh)，细胞在其中整 合并且相互作用。一种模拟这种天然构造的方式是通过交联人工聚合物来产生三维细胞培 养系统。
[0003] 细胞培养和组织工程领域取得了很好的进展，并且已经开发了多种ECM等同物。 这些等同物中用于骨架的材料不同，因此能够在其中繁殖的细胞类型也不同。
[0004] 纤连蛋白（FN)是一种介导细胞附着和生长的主要的ECM蛋白质。FN含有多种配 体，包括介导细胞粘附的三肽R⑶和肽PHSRN。天然来源的蛋白质（例如纤连蛋白）可用作 体内细胞附着的骨架。但是，利用任何动物来源蛋白质的一个潜在问题是有可能传播疾病。
[0005] 因此，已经提出了一系列再造天然三维组织的工程三维骨架。目前的三维骨架并 不理想（7)。例如，难以产生特定细胞系或组织类型特异性的骨架；这些骨架之间还具有高 的批与批可变性；在不影响这些骨架其他性质的情况下改变其单一的性质是复杂的。例如， 如果希望改变特定骨架的粘度，可能最终同时改变粘附配体的密度和骨架的呈现方式或者 孔隙率，这可能影响营养物通过骨架扩散的特性（11)。
[0006] 因此，仍然需要提供改进的细胞培养环境。
[0007] 发明概述
[0008] 在一个方面，本发明提供了包含至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的分 子伴侣/引领蛋白家族聚合物，其中所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体包含 外源生物活性序列。
[0009] 优选地,所述生物活性序列基本上无免疫原性。
[0010] 优选地，所述单体基本上不含天然存在的粘附基序。
[0011] 优选地，所述单体是FG环长家族（FG loop long family)多肽单体，例如，选自 CafUSafl和Afa/Dr的FG环长家族多肽单体。更优选地，所述单体是Cafl多肽。更优选 地，所述单体与SEQ ID NO : 5的多肽具有至少70%同一性。
[0012] 或者，所述单体是FG环短家族（FG loop short family)多肽单体，例如选自Fim 和Pap的FG环短家族多肽单体。
[0013] 优选地，所述生物活性序列选自细胞粘附识别基序、生长因子序列基序和蛋白酶 位点。更优选地，所述生物活性序列是细胞粘附识别基序。更优选地，所述细胞粘附识别基 序是胞外基质细胞粘附识别基序。更优选地，所述细胞粘附识别基序选自胶原蛋白、弹性 蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或生腱蛋白。优选地，所述细胞粘附识别基序包含氨基酸序列 R⑶。替代地或附加地，所述细胞粘附识别基序包含氨基酸序列PHSRN。
[0014] 优选地,所述生物活性序列包含在所述单体内这样的位点处,所述位点包含在所 述多肽折叠后的环结构内。
[0015] 优选地，所述聚合物是级分1抗原聚合物（fraction I antigen polymer)，并且所 述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是CAFl多肽单体。
[0016] 优选地，所述聚合物包含至少一种另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体，其 中所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体与所述包含外源生物活性序列的所述至 少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体至少有一个氨基酸不同。更优选地，所述另外的 分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是不具有所述外源生物活性序列的本文所述分子伴侣/ 引领蛋白家族多肽单体。
[0017] 优选地，所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是天然存在的CAFl多肽 单体。更优选地，所述至少一种天然存在的CAFl多肽单体是鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis) CAFl多肽。仍更优选地，所述鼠疫耶尔森氏菌CAFl多肽具有SEQ ID NO :5的多肽 序列。
[0018] 优选地，所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体包含这样的外源生物活性 序列，其不同于所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序 列。更优选地，所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序列 是包含氨基酸序列RGD的细胞粘附识别基序，并且其中所述至少一种另外的分子伴侣/引 领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序列是包含氨基酸序列PHSRN的细胞粘附识别 基序。
[0019] 在另一个方面，本发明提供了包含根据本发明的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物 的水凝胶。
[0020] 优选地，所述水凝胶还包含交联剂。更优选地，所述交联剂是生物可降解的交联 剂。或者，所述交联剂是不可降解的交联剂。
[0021] 优选地，所述交联剂包含聚乙二醇。
[0022] 在另一个方面，本发明提供了根据本发明的水凝胶作为细胞支持骨架的用途。
[0023] 优选地，所述骨架是2D细胞支持骨架。或者，所述骨架是3D细胞支持骨架。
[0024] 在另一个方面，本发明提供了包含根据本发明的水凝胶的伤口敷料。
[0025] 在另一个方面，本发明提供了根据本发明的水凝胶，其用于治疗伤口。
[0026] 优选地，所述伤口是慢性伤口，或者其中所述伤口是急性伤口。
[0027] 在另一个方面，本发明提供了包含根据本发明的水凝胶的眼植入物（ocular implant)〇
[0028] 在另一个方面，本发明提供了根据本发明的水凝胶，其用于治疗眼损伤。
[0029] 在另一个方面，本发明提供了用于制备包含至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多 肽单体的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的方法，所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族 多肽单体包含外源源生物活性序列，所述方法包括：
[0030] i)将编码包含外源生物活性序列之分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的核酸分 子并入用于在宿主细胞中表达的表达载体中；以及
[0031] ii)用所述表达载体转染宿主细胞；
[0032] 其中向所述宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质 分子伴侣的核酸分子和编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的 核酸分子，并且其中得到的经转染宿主细胞产生分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
[0033] 优选地，所述生物活性序列基本上无免疫原性。
[0034] 优选地，所述单体基本上不含天然存在的粘附基序。
[0035] 优选地，所述分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是级分1抗原聚合物，并且包含外源 生物活性序列的所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是CAFl多肽单体。更优 选地，编码包含外源生物活性序列之CAFl多肽单体的所述核酸分子与SEQ ID NO: 1的核苷 酸序列具有至少70%同一性。
[0036] 优选地，编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的所述核 酸分子编码CAFl特异性的周质分子伴侣，并且其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体 特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子编码CAFl特异性的外膜引领蛋白。更优选地，编码 CAFl特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子与SEQ ID NO :2的核苷酸序列具有至少70% 同一I"生。
[0037] 优选地，编码CAFl特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子与SEQ ID NO :3的核苷 酸序列具有至少70%同一性。
[0038] 优选地，如下向所述宿主细胞提供编码CAFl特异性之周质分子伴侣的核酸分子：
[0039] i)将编码CAFl特异性之周质分子伴侣的核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的 表达载体中；以及
[0040] ii)用所述表达载体转染宿主细胞。
[0041] 优选地，所述表达载体还包含编码含有细胞粘附识别基序之CAFl多肽单体的核 酸分子。
[0042] 优选地，如下向所述宿主细胞提供编码CAFl特异性之外膜引领蛋白的核酸分子：
[0043] i)将编码CAFl特异性之外膜引领蛋白的核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的 表达载体中；以及
[0044] ii)用所述表达载体转染宿主细胞。
[0045] 更优选地，所述表达载体还包含编码含有细胞粘附识别基序之CAFl多肽单体的 核酸分子和/或编码CAFl特异性之周质分子伴侣的核酸分子。
[0046] 优选地，还向所述宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之 表达调控子的核酸分子。更优选地，编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达 调控子的所述核酸分子编码CAFl特异性的表达调控子。
[0047] 优选地，编码CAFl特异性之表达调控子的所述核酸分子与SEQ ID NO :4的核苷酸 序列具有至少70%同一性。
[0048] 优选地，所述生物活性序列是细胞粘附识别基序。
[0049] 优选地，所述宿主细胞是细菌细胞。更优选地，所述细菌细胞是革兰氏阴性细菌细 胞。更优选地，所述细菌细胞是大肠杆菌（Escherichia coli.)。
[0050] 在另一个方面，本发明提供了级分1抗原聚合物作为防污剂（antifouling agent)的用途。
[0051] 在另一个方面，本发明提供了包含级分1抗原聚合物的防污组合物。
[0052] 附图简述
[0053] 下文参考附图进一步描述了本发明的一些实施方案，其中：
[0054] 图1是包含温度调节的caf操纵子的卡那霉素抗性质粒pAH34L的示意图，其包含 编码Fl抗原的基因以及参与鼠疫耶尔森氏菌（Y.pestis)的细菌细胞表面上Fl抗原的输 出和组装的其他基因（3,12)。
[0055] 图2是组装和输出到细菌细胞表面的Fl纤维的示意图。CaflM为蓝色；Cafl为红 色或绿色；Caf IA为金黄色。在阶段1，Fl亚单位（subunit)被分泌到周质中；在阶段2,在 周质中形成CaflM-Cafl复合物；在阶段3, Fl纤维开始形成长的聚合物（延长过程）。聚 合步骤释放Caf IM的一个分子（M)。Zaviolov和Knight报道过量的Caf IM分子被包装到 了四聚体中（T) (15)。供体序列用箭头表示=CaflM中的Al和Gl链形成序列为蓝色，Cafl 中的Gd链形成序列为红色或绿色。在CaflM-Cafl复合物中，CaflM的第一结构域与Cafl 形成了融合杂桶（fused hetero-barrel)。
[0056] 图3示出使用pAH34L载体作为模板进行的caf操纵子PCR扩增以及PCR产物的 限制性消化的结果。a)PCR扩增。M，分子大小标志物（大小，左侧空白处）；泳道l，caf操 纵子。右侧空白处，PCR产物的大小。b)PCR产物的限制性消化。分子大小标志物（大小， 左侧空白处）；泳道1，利用BamHI限制酶消化的caf操纵子，显示出3731bp和1520bp两个 条带；泳道2,利用HindIII消化的caf操纵子，显示出3490bp、1053bp和707bp三个条带； 泳道3,利用EcoRI消化的caf操纵子，显示出5200bp的单个条带，这是因为不存在特异性 EcoRI限制位点；泳道4,未消化的caf操纵子，显示出5200bp的单个条带。右侧空白处，以 kb为单位的DNA片段的大小。
[0057] 图4示出纯化的caf操纵子PCR产物及其限制性消化的特征。a) PCR产物的量化。 M，分子大小标志物（大小，表格中）；泳道U1，纯化的caf操纵子。b)PCR产物的限制性消 化。M，分子大小标志物（大小，左侧空白处）；泳道1，未消化的caf操纵子；泳道2,利用 EcoRI消化的caf操纵子，显示出5200bp的单个条带，这是因为不存在特异性EcoRI限制位 点；泳道3,利用BamHI限制酶消化的caf操纵子，显示出3731bp和1520bp两个条带；泳道 4,利用HindIII消化的caf操纵子，显示出3490bp、1053bp和707bp三个条带。右侧空白 处，DNA片段的大小（kb)。
[0058] 图5示出克隆在质粒pGEM-T EASY-caf操纵子（pGEM-TFl)中的Caf 1操纵子的代 表性测序结果，表明caf操纵子以cafR基因序列开始，并且caf操纵子以caf 1基因序列 结束。a)使用Expasy 工具（http://expasy.org/tools/dna.html)的cafR 基因序列。b) 使用 Expasy 工具（http ://expasy. org/tools/dna. html)的 cafl 基因序列。使用通用引 物如 17 启动子引物（5' -AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG-3')或 pUC/M13 正向引物 (5' -GTA AAA CGA CGG CCA GTG-3')对通过 pGEM-T EASY 载体产生的 ssDNA 测序。
[0059] 图6示出pGEM-TFl的限制性消化。凝胶电泳显示：M，分子大小标志物（大小，左 侧空白处）；泳道1，利用EcoRI消化的pGEM-TFl，显示出5. 2Kb和3Kb两个条带；泳道2， 未消化的pGEM-TFl，显示出8. 2Kb的单个条带。（a)图示出caf操纵子插入物（5. 2Kb)、 pGEM-TEASY载体（3Kb)和EcoRI切割位点；(b)图示出caf操纵子插入物（5. 2Kb)、pGEM-T EASY载体（3Kb)以及连接后得到的8. 2Kb的质粒。
[0060] 图7示出SDS-PAGE (左）和使用抗Caf 1抗体的western印迹（右）。泳道1包含 分子质量标志物蛋白质（箭头表不分子质量X 103kda)。分析的样品（10 μ 1)由在37°C培 养过夜的细菌细胞培养物大肠杆菌（pgem-tfl)制备。将蛋白质样品在95°C加热5分钟，并 向每一份样品添加等体积的SDS-PAGE缓冲液，然后将样品加样到12% SDS-PAGE凝胶上。 将1个凝胶用考马斯蓝r250染色（泳道3)，而另一个凝胶进行印迹。用抗Caf 1抗体探测 所得印迹（western印迹的泳道2)，然后用具有4cn (4-氯-1-萘酚）的HRP山羊抗小鼠抗 体（Sigma-Aldrich)显色溶液（colour development solution)进行显影。
[0061] 图8示出纯化的cafl蛋白的肽消化的质谱法，表明基因产物是成熟Cafl减去前 导肽。
[0062] 图9示出使用Superdex 200凝胶过滤柱的校准曲线。上图示出分布系数与log 分子质量之间的预期线性关系。下图示出校准蛋白质的实际洗脱曲线，表明约48ml的空隙 体积。图9在上图示出利用蛋白质对凝胶过滤柱的校准，并且下图示出其洗脱谱。
[0063] 图10示出Cafl蛋白纯化。a) Superdex 200FPLC上的凝胶过滤柱色谱。将cafl 级分（fraction)施加到Superdex 200凝胶过滤FPLC柱。Cafl主峰靠近空隙体积，表明已 经形成了长聚合物。WSDS-Page凝胶。泳道1含有分子质量标志物蛋白质（箭头表示分子 质量X 103kDa)。在纯化Superdex 200之后制备分析的样品（10 μ L)。由主峰收集级分并 且确认该峰中Caf 1的存在。将蛋白质的每一级分在95°C下加热并保持5分钟，并向每一样 品添加等体积的SDS-PAGE缓冲液，之后将样品加样到12% SDS-PAGE凝胶上。
[0064] 图11示出使用分光光度计对经纯化Cafl蛋白浓度的测量。
[0065] 图12示出cafl寡聚体的形成。将主要的Caf 1纯化级分（图8)在95°C下加热45 秒以诱导非共价聚合物的部分破碎。泳道1-5示出Cafl的寡聚化（使用新质粒pGEMTFl 表达）。泳道6示出在本研究中用作对照的商业纯的重组Fl (rFl)并且也在85°C下加热。
[0066] 图13示出CaflM:Cafl复合物。CaflM，分子伴侣（绿色）以及Cafl，Fl纤维（蓝 色）。图是使用Pymol软件（http ://www. pymol. org)使用已公布的PDB文件1P5U产生的。 A)F1氨基酸序列示出用于并入RGDS肽的Fl纤维的环（用鲜肉色、粉红色、橙色、深蓝色和 黄色突出）。
[0067] 图14示出测序结果，表明RGDS肽成功插入到了 Fl环中。上图：cafl基因序列 (GenBank，登录号AY450847)的反向测序和blast的色谱图，使用Expasy工具（http :// expasy.org/tools/dna.html)。下图：cafl 基因序列（GenBank，登录号 AY450847)的反向 测序和 blast 的色谱图，使用 Expasy 工具（http ://expasy. org/tools/dna. html)。使用通 用引物 17 启动子引物（5' -AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG-3')对由 pGEM-TFl 载 体产生的ssDNA测序。
[0068] 图15示出尺寸排阻色谱之后纯化的CaflQDGN76RGDS突变体的级分。泳道2-9示 出当样品在95°C下加热不同时间的CaflQDGN76RGDS突变体寡聚体。
[0069] 图16示出Cafl的纤维的电子透射显微图像。图像是使用Phillips CMlOO电子 透射显微镜获得的。用2% (w/v)乙酸双氧铀（uranyl acetate)对Cafl和Cafl-RGDS蛋 白样品染色。所使用的图像放大率为130000X。
[0070] 图17示出使用涂覆有Cafl和Cafl-RGDS蛋白的玻璃盖玻片的PCI2细胞粘附测 定。图像是使用Zeiss荧光显微镜获得的。如在每一组图像旁边指出的，所使用的图像放 大率为400X和200X。比率尺=20μπι。染色剂为DAPI (蓝色）和若丹明鬼笔环肽（橙 色）。
[0071] 图18比较了纤连蛋白和本发明的经修饰CAFl聚合物中RGDS肽的结构。
[0072] 图19示出本发明优选的交联方法的示意图。球体代表适于交联的赖氨酸残基位 点。
[0073] 图 20 示出扫描电子显微图像：A、B、D-CAFl : 4NHS-PEG(1 : 5); C-CAFl : 4NHS-PEG(1 : 2) ;A、B、C-2 % 戊二醛固定；D-冻干处理；E-附着在 CAFl : 4NHS-PEG(1 : 5)水凝胶上的大鼠成骨细胞。比例尺：50ym(A、B、C和D)和 200 μ m(E)。
[0074] 图21示出生长在涂覆有A)纤连蛋白和B)包含RDGS的CAFl之表面上的大鼠原 代成骨细胞的SEM和荧光显微图像。比例尺：10 μ m。
[0075] 图22是SEQ ID NO :1的核酸序列。
[0076] 图23是SEQ ID NO :2的核酸序列。
[0077] 图24是SEQ ID NO :3的核酸序列。
[0078] 图25是SEQ ID NO :4的核酸序列。
[0079] 图26是SEQ ID NO : 5的氨基酸序列。
[0080] 图27是SEQ ID NO :6的氨基酸序列。
[0081] 图28是SEQ ID NO : 7的氨基酸序列。
[0082] 图29是SEQ ID NO :8的氨基酸序列。
[0083] 图30是SEQ ID NO :9的氨基酸序列。
[0084] 图31是SEQ ID NO : 10的核酸序列。
[0085] 图32是SEQ I