一种靶向肽修饰的金纳米颗粒及其制备方法和其作为四价铂前体药物载体的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤靶向和安全治疗技术领域。具体地，涉及一种肝癌细胞靶向肽修 饰的纳米金颗粒，以及其制备方法和其在制备四价铂前体药物载体中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌（简称肝癌）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，同时也是我国最常见的 恶性肿瘤之一，中国肝癌发病率占全球的45%，死亡率高居恶性肿瘤的第三位。肝癌起病 隐匿，早期缺乏典型症状，进展快，恶性程度高，预后差，绝大部分发现时已属于中晚期。肝 细胞癌的治疗主要以手术、化疗和放疗为主，但是化疗药物作用大多为非选择性，体内分布 广，治疗剂量下对正常组织器官毒副作用大，包括胃肠道反应、骨髓抑制作用、肾毒性和药 物耐受性降低等；据统计，95%以上的肝癌患者治疗失败。
[0003] 顺钼（Cisplatin，⑶DP)是一个含钼的抗肿瘤药物，即顺式-二氯二氨合钼（II)， 属于细胞周期非特异性药物，对肉瘤、恶性上皮肿瘤、淋巴瘤及生殖细胞肿瘤都有治疗功 效。它是一大类铂类药物中最早被合成的一个，结构最简单且作用机理明确。但是顺铂的 副作用很多，包括：肾脏毒性、恶心、呕吐，神经毒性、耳毒性、秃头症以及电解质紊乱；同时 顺铂使用的时间较长时，大部分病人都会对顺铂产生抗性，从而疾病复发；寻找新的方法用 于改进顺铂的治疗是很有必要的。
[0004] 四价铂化合物作为顺铂的前药，具有水溶性好、毒性低、口服利用度高等优点，在 临床试验中表现出良好的抗肿瘤活性，并对顺铂耐药细胞仍然保持较好的活性。同时，四价 铂化合物在药物修饰和药物运输体系设计中具有极大的优势。
[0005] 纳米金颗粒具有低毒、生物相容性高并且易于修饰化学基团等优点，可安全的应 用于人类肿瘤治疗。研宄表明，由于纳米金的尺寸较小，肿瘤组织提高了对它的通透性，使 得纳米金颗粒静脉注射后会在肿瘤部位聚集。
[0006] 根据文献 1 (自然综述?癌症--Nature Reviews Cancer，2005, 5:161-171)报 道，肿瘤组织附近的血管内皮与正常的血管内皮相比具有较高的通透性，因而金纳米颗粒 可以渗透到肿瘤组织中，再由细胞内吞作用进入肿瘤细胞中。将药物装载到纳米颗粒表面， 即可达到运输药物的目的。棒状的金纳米颗粒在近红外波段具有较高的光吸收截面和优良 的光热转换效率，研宄表明，纳米金棒以及相关的纳米结构可以通过光热疗法，在较小的光 照剂量下杀死癌细胞，而不会破坏周围的细胞，因而，纳米金颗粒具有药物载体的功能。
[0007] SP94序列是一个靶向肝癌细胞的多肽。它是由体内噬菌体展示技术发现的多肽， 并且对多种肝癌细胞表现出了选择性结合，而对于正常细胞（正常肝细胞、内皮细胞、免疫 细胞等）只有少量结合。在移植了人类肝癌细胞的联合免疫缺陷的小鼠实验中，SP94会选 择性与肝癌组织结合而非内脏器官；良好的选择性使SP94可以成为一种实用的肝细胞癌 靶向配体。
[0008] 靶向肽修饰的纳米金颗粒可以显著提高其生物兼容性，增加对癌细胞的选择性， 降低毒副作用。现有技术中将多肽修饰到纳米金颗粒表面的方法有两种，一种是通过链接 剂将多肽修饰到纳米金颗粒表面，例如文献2(Langmuir，2001，17(20) :6368-74)使用聚乙 二醇（PEG)修饰纳米金颗粒后可以与多肽结合。第二种是通过形成金硫键直接将多肽修饰 在纳米金颗粒表面，例如文献3 (Bioconjugate Chemistry, 2012, 23 (7) : 1494-501)所用的 (GCGC)序列。
[0009]因此，开发一种具有肝癌细胞靶向作用的纳米金颗粒作为药物载体将铂类药物运 输到肿瘤细胞内部，对肿瘤的化疗很有帮助，目前这类技术较多，但是用肝癌细胞靶向肽 SP94修饰的金纳米颗粒，至今尚未见到过报道。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种用作为运载铂类药物的肝癌细胞靶向肽修饰的金纳米 颗粒的药物载体及其制备方法，以提高金纳米颗粒的对肝癌细胞的选择性，减小其对正常 细胞的非特异性结合并可控释放铂类药物。同时提供该肝癌细胞靶向肽修饰的纳米金颗粒 在制备药物载体中的应用。
[0011] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0012] -种肝癌细胞祀向肽修饰的金纳米颗粒，所述祀向肽修饰的金纳米颗粒对肝癌细 胞具有选择性。
[0013] 根据所述的一种肝癌细胞靶向肽修饰的金纳米颗粒，其中所述的靶向肽含有 14-20个氨基酸，其中包含具有肝癌细胞靶向作用的SFSIIHTPILPL即SP94序列，所述的肽 序列中含有1-3个半胱氨酸残基。
[0014] 根据所述的一种肝癌细胞靶向肽修饰的金纳米颗粒，所述的肝癌细胞靶向肽修饰 的金纳米颗粒是通过肽分子中的巯基与金形成金硫共价键将肽连接到金纳米颗粒的表面。
[0015] 根据所述的一种肝癌细胞革El向肽修饰的金纳米颗粒，该革El向肽修饰的金纳米颗粒 是通过如下步骤所制得的：
[0016] (1)制备十六烷基三甲基溴化氨（CTAB)稳定的金纳米颗粒：用十六烷基三甲基溴 化氨作为软性模板剂，采用种子生长法制备金纳米颗粒或者用柠檬酸钠作为还原剂制备金 纳米颗粒；
[0017] ⑵制备靶向肽结合的金纳米颗粒：向步骤⑴金纳米颗粒溶胶，中加入肝癌细胞 革巴向肽1~5mg/ml反应；反应4~8小时后，通过离心的方法将没有反应的肽去除，将反 应液在5000~14000转/分钟下离心3~30分钟，祀向肽结合的金纳米颗粒被沉淀在离 心管底部；然后再将纳米颗粒超声分散于水中，如此重复多次，洗净靶向肽结合的金纳米颗 粒。
[0018] 所述的一种肝癌细胞靶向肽修饰的金纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
[0019] (1)制备十六烷基三甲基溴化氨CTAB稳定的金纳米颗粒：用十六烷基三甲基溴化 氨作为软性模板剂，采用种子生长法制备金纳米颗粒或者用柠檬酸钠作为还原剂制备金纳 米颗粒；
[0020] (2)制备靶向肽结合的金纳米颗粒：向步骤⑴金纳米颗粒溶胶，中加入肝癌细胞 革巴向肽1~5mg/ml反应；反应4~8小时后，通过离心的方法将没有反应的肽去除，将反 应液在5000~14000转/分钟下离心3~30分钟，祀向肽结合的金纳米颗粒被沉淀在离 心管底部；然后再将纳米颗粒超声分散于水中，如此重复多次，洗净靶向肽结合的金纳米颗 粒。
[0021] 根据所述的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0022] (1)金纳米颗粒的制备：
[0023] 金纳米种子溶液的制备：称取十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶于7. 5ml水中，在热 水中使之完全溶解，然后冷却至室温，将硼氢化钠（NaBH4)溶于冰水中，配置成10毫摩尔/ 升浓度的溶液，在CTAB溶液中加入250 μ 1的氯金酸溶液，轻微震荡，迅速加入600 μ 1新制 备、冷冻的NaBH4，超声2分钟排除气泡，在37°C水中恒温2小时以上；
[0024] CTAB稳定的金纳米颗粒的制备：先称量CTAB溶于水中，热水浴使之完全溶解，然 后冷却至室温，在溶好的CTAB溶液中依次加入盐酸、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸，摇匀为无 色后，加入种子溶液，超声2分钟排除气泡，放入37°C水浴过夜；
[0025] (2)靶向肽修饰的金纳棒的制备
[0026] 取肝癌细胞靶向肽溶于水中，加入纳米金棒溶胶，缓慢升温至55°C，恒温水浴3小 时后，室温下轻微搅拌2小时，用6000转/分钟，10分钟离心二次去除沉淀；
[0027] (3)带焚光基团的革巴向肽修饰的纳米金棒
[0028] 取罗丹明B，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，N-羟基丁二酰亚胺 (N-Hydroxysuccinimide，NHS)溶于水中，避光放置20分钟，加入革El向肽修饰的纳米金棒溶 液，避光搅拌反应24小时；
[0029] 用离心机转速6000转/分钟，离心时间10分钟多次离心去除上清液并浓缩体积；
[0030] (4)细胞靶向实验
[0031] I.复苏
[0032] 复苏的细胞有肝癌细胞0fepG2细胞），正常肝细胞（7702细胞）、人体肺腺癌上皮 细胞（A549细胞）。
[0033] 从_80°C冰箱张取出冻存的细胞，温水浴直至融化，用移液枪吸取细胞悬液，滴入 10倍以上的培养液混匀后离心并去除上清液；接着用含有10%胎牛血清的培养液将细胞 重悬并计数，调整密度，然后在培养瓶中接种，37°c进行培养，培养液每天更换一次；
[0034] II.靶向实验
[0035] 细胞靶向实验选用对数生长期细胞2 X IO4个/ml接种在24孔板内，每孔100 μ 1， 培养24小时后更换新鲜的培养基，设置实验组、对照组和空白组，实验组加入不同浓度梯 度的药物，对照组不加入药物，空白组没有接种细胞且不加药物，继续培养4小时后除去培 养基；
[0036] 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μ 1，铺板使待测细胞调密度至 10万个/孔，边缘孔用无菌磷酸缓冲液填充；5% C02 , 37°C孵育，培养12小时；第二天进行 加样，5% C02,37°C孵育4小时；弃去旧的培养基加入新鲜培养基100 μ 1，用磷酸缓冲液洗 一次；每孔加入100 μ 1消化液，使细胞裂解，消化结束后加入大量磷酸缓冲液置于I. 5ml离 心管中，用离心机转速1500转/分钟、时间5分钟进行离心，除去上清液；加入1ml磷酸缓 冲液离心洗涤1次，弃去上清液，洗净后加入〇. 5ml磷酸缓冲液，配置成悬浮液后使用流式 细胞仪进行分析。
[0037] 本发明的一种肝癌细胞靶向肽修饰的金纳米颗粒的制备方法可更具体地表述如 下：通过形成金硫作用的共价键方式将肝癌细胞靶向肽连接到金纳米颗粒的表面。
[0038] 包括如下具体步骤：
[0039] 第一步，制备十六烷基三甲基溴化氨（CTA