高抗人源肿瘤细胞活性的灵芝总三萜纯化物及其纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有高抗人源肿瘤细胞活性的灵芝总三萜纯化物及其纯化方法，尤其 涉及利用大孔树脂、MCI GEL树脂和聚酰胺对灵芝总三萜的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。现代研究表明，灵芝的主要化学 成分包括糖类、三萜类、留醇类、核苷、氨基酸及生物碱类等，具有抗肿瘤、防艾滋、保肝排 毒、抗衰老、降血脂、安神镇静等药理活性，因而被开发为药品、食品、保健品。
[0003] 随着现代社会的发展，癌症患者人数正在逐年增长，已经成为人们急需攻克的疾 病。三萜类物质是灵芝中主要的抗肿瘤物质，它可以抑制肿瘤细胞的分裂和增殖、抑制肿瘤 细胞的侵袭和转移，促进肿瘤细胞的死亡，具有广谱的抗肿瘤细胞活性，所以对灵芝三萜物 质的制备及其在抗肿瘤方面的深入研究已经成为一个热点。
[0004] 目前在灵芝三萜的纯化技术上，现有技术多采用有机溶媒萃取，如专利 CN1546519A,使用试剂氯仿及其饱和碳酸氢钠溶液萃取,但该法不仅使用了有毒试剂,而且 不能保持灵芝三萜有效成分的完整性；公开号CN102772448A，该法虽然采用了大孔树脂对 灵芝三萜进行纯化，保持灵芝三萜有效成分的完整性，但该法大量使用了酸碱，这不仅对树 脂损害较大，而且酸碱的使用也可导致物质的变化，不宜于长期工业化生产；灵芝提取物的 色素颜色较深，对成分含量影响较大，目前技术较多使用活性炭脱色，但该法脱色过程中， 活性炭会吸附大量的灵芝三萜类成分，严重影响灵芝三萜的收率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供一种适宜于工业生产、工艺简单、生产速度快、生产成本 低、灵芝总三萜纯度高、影响抗肿瘤活性杂质少和所用试剂无毒且可循环利用的高抗人源 肿瘤细胞活性灵芝总三萜的纯化方法。其方法包括以下步骤： 1) 对灵芝子实体醇提液进行浓缩，使其乙醇的体积分数为〇%~20% ; 2) 将步骤1)所得物通过大孔树脂，上样流速为0.5 BV/h~5 BV/h，再进行洗脱，洗脱 时先用4~8倍柱体积水洗脱，洗脱流速为2BV/h~6BV/h，弃去水洗部分，再用4~8倍柱 体积乙醇洗脱，乙醇体积分数为60%~90%，洗脱流速为lBV/h~4BV/h，收集醇洗脱液； 3) 将步骤2)中所得醇洗脱液减压旋干，得到初步纯化物，再加入重量为初步纯化物 2-5倍的乙醇，搅拌溶解； 4) 将步骤3)所得物通过MCI GEL树脂，上样完后，先加入去离子水洗脱到流出液无醇 味，再用6~8倍柱体积乙醇溶液洗脱，乙醇体积分数为10%~30%，弃去该部分洗脱液，再 用体积分数为80%~90%的乙醇洗脱，乙醇用量为4~8倍，收集洗脱液； 5) 将步骤4)所得醇洗脱液过聚酰胺柱进行脱色，取脱色液； 6) 浓缩脱色液，然后进行喷雾干燥，获得具有高抗人源肿瘤细胞活性的灵芝总三萜纯 化物。
[0006] 优选的，所述大孔树脂是D-101苯乙烯型大孔树脂或HPD-100苯乙烯型大孔树脂。
[0007] 优选的，步骤2)中，洗脱时先用4~8倍柱体积水洗脱，洗脱流速为2BV/h~6BV/ h，再用4~8倍柱体积乙醇洗脱，乙醇体积分数为60%~90%，洗脱流速为lBV/h~4BV/h。 在此操作参数范围内，洗脱液中的灵芝总三萜含量较高。
[0008] 所述的灵芝醇提液是利用乙醇对灵芝子实体回流提取而得，先将灵芝子实体粉 碎，再加入质量为灵芝子实体的4~6倍量体积分数为为60%~80%的乙醇回流提取1~ 3h，回流提取2~4次，即得灵芝醇提液。
[0009] 所述步骤2)中大孔树脂的用量为灵芝子实体的0. 5~1. 5倍。
[0010] 优选的，步骤3)中，先加入去离子水洗脱到流出液无醇味，再用6~8倍柱体积乙 醇溶液洗脱，乙醇体积分数为10%~30%，弃去该部分洗脱液，再用体积分数为80%~90%的 乙醇洗脱，乙醇用量为4~8倍。
[0011] 单纯利用大孔树脂纯化，灵芝总三萜含量纯度和含量不高，无法具备高抗人源肿 瘤细胞活性，通过MCI GEL的再次纯化，可以进一步除去极性较大的物质，如核苷等成分，以 及影响抗肿瘤活性的杂质，以提高总三萜的纯度及纯化物的抗肿瘤活性。通过MCI GEL树 脂纯化后，总三萜的纯度最少能提高10%，并基本清除影响抗肿瘤活性的杂质。
[0012] 所述步骤5)的流速为2~6BV/h。
[0013] 所述步骤5)中所述聚酰胺的用量为灵芝子实体重量的0. 5~1. 5倍。
[0014] 所述具有高抗人源肿瘤细胞活性的灵芝总三萜纯化物中，灵芝总三萜含量不低于 60%，总三萜中九个指标性成分所占的重量百分比为： 灵芝酸C2 1. 5%~3. 0% 灵芝酸C6 1. 0%~2. 2% 灵芝酸G 3. 1%~6. 0% 灵芝酸 A 10. 0%~25, 0% I2~hydroxy-3, 7, 11, 15, 23-pentaox〇-5 α -1anost-8-en-26-〇ic acid I. 2% ~3. 5% 灵芝酸D 5· 0%~18. 5% 灵芝酸F 3· 2%~10. 0% 灵芝醇A 0. 5%~4. 8% 灵芝酮三醇 2. 5%~10. 5% 本发明的第二个目的是提供一种具有高抗人源肿瘤细胞活性的灵芝总三萜，所述灵芝 总三萜含量至少为60%，总三萜中九个指标性成分所占的重量百分比为： 灵芝酸C2 L 5%~3. 0% 灵芝酸C6 L 0%~2. 2% 灵芝酸G 3. 1%~6. 0% 灵芝酸 A 10. 0%~25, 0% I2~hydroxy-3, 7, 11, 15, 23-pentaox〇-5 α -1anost-8-en-26-〇ic acid I. 2% ~3. 5% 灵芝酸D 5· 0%~18. 5% 灵芝酸F 3· 2%~10. 0% 灵芝醇A 0. 5%~4. 8% 灵芝酮三醇 2. 5%~10. 5% 本发明所制备得的灵芝总三萜纯化物，相对于现有技术(如CN102772448A)，不仅在总 三萜含量上得到了显著性的提高，同时九个主要指标性成分的含量比较为合理，特别是具 有重要抗人源肿瘤细胞活性的灵芝酸A，不仅结构完整，而且含量高。
[0015] 一般而言，常规的纯化方法所得到的灵芝总三萜纯化物的抗肿瘤活性不高，不仅 需要较高的施加量，还伴生纯度不高导致的副反应。本发明的一个实施例显示，本发明所制 备得到的灵芝总三萜纯化物具有明显的抗人源肿瘤细胞活性。
[0016] 本发明与现有技术相比具有以下优点： (1)本发明中采用树脂纯化灵芝总三萜过程简单，纯化过程中无需加入大量酸碱调节 pH，从而避免酸碱对树脂的损耗及其繁琐的后处理，使用的溶媒无毒，可回收循环使用，避 免了对人体及其环境的损害。
[0017] (2)本发明获得的灵芝总三萜具有高抗人源肿瘤细胞活性，无需后续繁琐再纯化 处理，具有较大医用潜力。
[0018] (3)本发明中所用的聚酰胺脱色方法，相对于传统的活性碳脱色方法，不仅脱去色 素的效果较好，而且对灵芝三萜成分的吸附较小。
[0019] (4)本发明所制备的灵芝三萜纯化物中三萜成分完整，灵芝总三萜及九种指标性 成分的含量高，抗人源肿瘤细胞效果明显。
[0020] (5)灵芝三萜生产成本低，生产效率高，产品质量稳定，适宜于工业化生产。
【附图说明】
[0021] 图1为灵芝总三萜纯化物的HPLC检测结果。图1中，九种指标性成分的情况为： 灵芝酸C2 (1号峰)，灵芝酸C6 (2号峰)，灵芝酸G (3号峰），灵芝酸A (7号峰），12-hydroxy -3, 7, 11，15, 23-pentaoxo_5 a -lanost-8-en_26-〇ic acid (10 号峰），灵芝酸 D (12 号峰）， 灵芝酸F (15号峰），灵芝醇A (23号峰），灵芝酮三醇（25号峰)。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0023] 本发明中灵芝总三萜含量测定方法用紫外分光度法测定。含量测定条件为：对照 品为灵芝酸A，显色剂：浓硫酸-香草醛，测定波长：480nm。
[0024] 本发明中九个指标性成分含量测定方法用HPLC测定。HPLC测定条件：流动相： 乙臆：0· 1% 醋酸梯度洗脱，色谱柱：UltimateXB-C18(Welch Materials 4. 6 mmX250 mm, 5 Pm),柱温：30 °C，检测波长：254 nm，流速：0· 8 mL/min。
[0025] 实施例1 取灵芝子实体10 kg，粉碎，加入体积分数为60%的乙醇40 L回流提取2h，加热°C温度 80°C，过滤，残渣再加入体积分数为60%的乙醇40 L回流提取一次，合并提取液，将提取液 浓缩，浓缩液中乙醇浓度为20%，。将浓缩液上处理好的HPD-100苯乙烯型大孔树脂柱，树脂 用量5 kg，上样流速0.5 BV/h，上样完成后加入60 L去离子水洗脱，洗脱流速2 BV/h，弃去 水洗脱液，再用体积分数为60%的乙醇洗脱，洗脱流速I BV/h，收集醇洗脱液。醇洗脱液减 压旋干，再加入2倍重的乙醇溶解，上样MCI GEL柱分离纯化，上样完后，先加入去离子水洗 脱到流出液无醇味,再加入乙醇溶液6倍柱体积洗脱，乙醇体积分数为10%，弃去该部分洗 脱液，再用体积分数为80%的乙醇洗脱，乙醇用量4倍，收集该部分醇洗脱液，将醇洗脱液通 过聚酰胺柱脱色，流速2 BV/h，聚酰胺用量5 kg，收集脱色后的醇洗脱液，浓缩到无醇味，直 接喷雾干燥，得灵芝三萜纯化物240 g，经检测灵芝总三萜含量60%。
[0026] 实施例2 取灵芝子实体10 kg，粉碎，加入体积分数为70%的乙醇60 L回流提取2h，加热°C温度 80°C，过滤，残渣再加入体积分数为70%的乙醇40 L回流提取两次，合并提取液，将提取液 浓缩，浓缩液中乙醇浓度为5%，。将浓缩液上处理好的D-101苯乙烯型大孔树脂柱，树脂用 量10 kg，上样流速2 BV/h，上样完成后加入80 L去离子水洗脱，洗脱流速4 BV/h，弃去水 洗脱液，再用体积分数为85%的乙醇洗脱，洗脱流速2 BV/h，收集醇洗脱液。醇洗脱液减压 旋干，再加入4倍重的乙醇溶解，上样MCI GEL柱分离纯化，上样完后，先加入去离子水洗脱 到流出液无醇味，再加入乙醇溶液7倍柱体积洗脱，乙醇浓度30%，弃去该部分洗脱液，再用 体积分数为90%的乙醇洗脱，乙醇用量6倍，收集该部分醇洗脱液，将醇洗脱液通过聚酰胺 柱脱色，流速4 BV/h，聚酰胺用量10 kg，收集脱色后的醇洗脱液，浓缩到无醇味，直接喷雾 干燥，得灵芝三萜纯化物220 g，经检测灵芝总三萜含量80.