白僵蚕蛆虫蛋白质的制备方法及其在制备抗乳腺癌药品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物的制备方法及其新用途，尤其是白僵蚕蛆虫蛋白质的制备方 法及其在制备抗乳腺癌药品中的应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性乳房腺上皮组织生长的恶性肿瘤，排名女性恶性肿瘤发病率第一 位。一般认为乳腺癌发病除与出生地的因素外，还与病毒、内源性或外源性雌激素的长期不 正常刺激、乳腺非典型增生、遗传、营养因素、放射线等因素有关。
[0003] 常用治疗乳腺癌的方法有：外科手术法、放疗法、化疗法、药物治疗。
[0004] 201110371596. 2公开了一种可高效高特异性灭杀乳腺癌细胞的药物，所述药物 T-VISA-BiKDD脂质体，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-BiKDD治疗载体。
[0005] 201010257844. 6公开了一种抗乳腺癌转移的中药组合物，由生晒参、巴戟天、荔枝 核、黄精、刺五加、路路通组成。
[0006] 201110197692.X公开了黄酮类化合物的抗乳腺癌用途，所述的黄酮类化合物是从 小叶莲中分离得到的。
[0007] 201110280031. 3公开了针对乳腺癌Her2/new的纳米抗体或多肽涉及对乳腺癌过 表达表皮生长因子受体2 (Her2/new)的多肽和纳米抗体及制备纳米抗体和多肽的方法。
[0008] 201110222789. 1公开了一种治疗乳腺癌的中药组合物及其制备方法，该中药组合 物是由鳖甲、牡蛎、昆布、海藻、地骨皮、沙参、山楂、木香、西洋参、柴胡、茯苓、羚羊角、血竭、 王不留行、甘草组成。
[0009] 201010128441. 1公开了蛇床子素衍生物及其制备方法和在制备抗乳腺癌药物中 的应用，该方法是用蛇床子素五起始原料，经还原溴化、催化偶联剂制得蛇床子素衍生物。
[0010] 原则上，上述的各种药物对治疗乳腺癌都有一定效果，但是中草药生长受到品种、 地域、气候、采收时间的影响，药材质量难于保持一致。因此，研宄治疗效果更佳、毒副作用 较低的药品是需解决的问题之一。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种白僵蚕蛆虫蛋白质的制备方法及其在制备抗乳腺癌药 品中的应用。白僵蚕蛆虫是以白僵蚕为主要原料，经生物转换技术生成白僵蚕蛆虫，再提取 出其蛋白质，用于制备治疗乳腺癌药品。白僵蚕蛆虫蛋白质生物活性明显增加，产品一致性 好，成本低，对乳腺癌治疗效果显著，具有较好的工业化生产价值。
[0012] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000 g白僵蚕蛆虫在常温膨化装置（200520108339.X)中常温条件下膨化粉碎。
[0013] 本步骤中，所述膨化压力为0?l~5MPa，时间为10~60min。
[0014] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出白僵蚕蛆虫蛋白质粗品。
[0015] 本步骤中，所述膨胀溶剂由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH3 ?H2O组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。
[0016] 本步骤中，所述提取温度为10~20°C，时间为10~30min。
[0017] (3)收集含有白僵蚕蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
[0018] 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~50Mm。
[0019] (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的白僵蚕蛆虫蛋白质超滤溶液。
[0020] 本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
[0021] (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
[0022] 本步骤中，所述溶剂为乙腈。
[0023] (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。
[0024] 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。
[0025] (7)纯化后的白僵蚕蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
[0026] 本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。
[0027] (8)赋予不同的药用辅助材料，分别制备成注射剂、口服剂等，可用于制备抗乳腺 癌药品。
[0028] 本发明的优点和有益效果如下：通过本发明分离纯化的白僵蚕蛆虫蛋白质 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为 11. 6~13.IKPa;用等电聚焦发测定其等电点为pH8. 9~10. 1;常规化学法分析结果表明其不 含糖类和磷酸基团；紫外分光光度法分析在260nm和280nm测定纯化的白僵蚕蛆虫蛋白质 含量为97. 8%;分子结构属非典型、非单一的昆虫蛋白质，链内与链间不含二硫键，其三级 结构构象单元以无规卷曲为主，a螺旋与0折叠的含量比例基本相当。本发明制备的白 僵蚕蛆虫蛋白质制剂质量稳定，结构清楚，药理明晰，疗效明显，含量可检可测，剂型多样， 成本较低，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0030] 实施例1: (1) 将1000 g白僵蚕蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置 内充入二氧化碳气体并加压至0.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，白僵 蚕蛆虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的白僵蚕蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6) 中，加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 *H20,加压至2~10MPa，形成 膨胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，白僵蚕蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后 降压至常压，生成白僵蚕蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有白僵蚕蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处 固体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的白僵蚕蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm; (7) 纯化后的白僵蚕蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50°〇、时间18~2611干燥 制备成冻干蛋白粉。
[0031] 实施例2: (1) 将1000 g白僵蚕蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置 内充入二氧化碳气体并加压至0.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，白僵 蚕蛆虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的白僵蚕蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6) 中，加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ?H2O,加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系， 保持温度15°C，时间20min，白僵蚕蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成白僵 蚕蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有白僵蚕蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径30Mm的微孔过滤器过滤去处固体 杂质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的白僵蚕蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用1〇~80%的乙腈梯度脱洗，流速 5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率I. 0KW，频率500KHz，流速200mL/ min，紫外检测器波长260nm; (7) 纯化后的白僵蚕蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~40°C、时间20h干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0032] 实施例3: (1) 将1000 g白僵蚕蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置 内充入二氧化碳气体并加压至0.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，白僵 蚕蛆虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的白僵蚕蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6) 中，加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成 膨胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，白僵蚕蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后 降压至常压，生成白僵蚕蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有白僵蚕蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处 固体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的白僵蚕蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)溶剂体系中， 用超声驻波液相制备色谱（200920274485. 8 )分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外检测器波长 260~280nm; (7) 纯化后的白僵蚕蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50°〇、时间18~2611干燥 制备成冻干蛋白粉。
[0033] 实施例4: (1) 将1000 g白僵蚕蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置 内充入二氧化碳气体并加压至2MPa，时间40min，然后迅速释放压力至常压，白僵蚕蛆虫被 膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的白僵蚕蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6) 中，加入6Kg液态二氧化碳、20