生物改性蓖麻蛋白质在制备抗恶性胸腺肿瘤药品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物的新用途，尤其是生物改性蓖麻蛋白质在制备抗恶性胸腺肿 瘤药品中的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性胸腺肿瘤是胸腺上皮异常增生法生成为肿瘤，临床上将胸腺癌和具有恶性侵 犯及转移的胸腺瘤统称为恶性胸腺肿瘤。
[0003] 现在常用的治疗方法为放射疗法、化学药物疗法和外科手术治疗方法。中医则将 恶性胸腺肿瘤根据症状分为：阴虚寒盛型、肺气壅滞型、气滞血瘀型痰气凝结型、肺虚瘀结 型，根据症状的不同类型，使用不同的方剂进行治疗。
[0004] CN102770456A公开了多特异性抗体、抗体类似物、组合物和方法，该发明提供了特 异性结合至少两个不同表达的多特异性抗体，还提供了天然抗体的结构性变体(抗体类似 物)。
[0005] CN102281902A公开了用于减少天分子在生理条件下聚集的方法和制剂，该发明提 供了用于皮下施用大分子的药物制剂和治疗CD20阳性癌症或自身免疫的方法。
[0006] CN1248919公开了以细菌菌体成分为有效成分的癌症免疫治疗剂，该治疗剂以细 菌菌体成为有效成分，当通过皮下给药投给具有免疫应答能力的患者时，可以诱导患者产 生免疫应答能力。
[0007] CN103781487A公开了用于增强免疫应答的组合物和方法，该发明涉及包含被照射 的微生物物种的药物组合物。
[0008] CN103655563A公开了抑制突变型C-KlT的方法，该发明包括降低或抑制细胞或对 象中C-KlT突变体酪氨酸激酶活性的方法以及与利用该发明化合物或其药学上可接受的 盐相关的此类化合物在治疗患者中突变型C-KlT驱动细胞增殖性疾病中的应用。
[0009] 蓖麻是大戟科蓖麻属植物，蓖麻种子含有蓖麻毒素、血细胞凝集素等成分，蓖麻毒 素是一种蛋白质毒素，存在于蓖麻籽的蛋白质中。
[0010] 蓖麻毒素是由两条多肽链组成，N-末端的氨基酸是异亮氨酸（lie)和丙氨酸 (Ala)，根据末端氨基酸命名为Ile链（即A链）和Ala链（即B链)，两链间由一个二硫键连 接。
[0011] 实验证明：以二硫键结合A链、B链的蓖麻毒素毒性很强，但是分离的A链、B链混 合在一起却没有毒性，故毒素的两链以二硫键的结合对毒性是重要的，这是一个奇妙的现 象。
[0012] 201210316220. 6公开了蓖麻蛋白的生物改性工艺，该发明生物改性过程首先诱导 昆虫逐渐嗜硫到一定程度后加入到含蓖麻毒素的培养基中，可以对蓖麻毒素A链与B链间 的双硫键快速进行切割，并与切割后的A链和B链分别产生抗性应答物，既消除蓖麻毒素的 毒性，又充分利用A链与B链的生物活性制备出一种独特蛋白。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种生物改性蓖麻蛋白质在制备抗恶性胸腺肿瘤药品中的 应用，利用生物改性蓖麻虫体为原料，经过分离纯化蛋白质，再用此蛋白质制备各种剂型的 药品，本过程工艺简要明了，药品成分明确，一致性好，疗效明显。
[0014] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000 g生物改性蓖麻虫体在常温膨化装置（200520108339.X)中常温条件下膨化 粉碎。
[0015] 本步骤中，所述膨化压力为0?l~5MPa，时间为10~60min。
[0016] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出生物改性蓖麻蛋白质粗品。
[0017] 本步骤中，所述膨胀溶剂由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH3 ?H2O组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。
[0018] 本步骤中，所述提取温度为10~20°C，时间为10~30min。
[0019] (3)收集含有生物改性蓖麻蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
[0020] 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~5〇Mm。
[0021] (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的生物改性蓖麻蛋白质超滤溶液。
[0022] 本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
[0023] (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
[0024] 本步骤中，所述溶剂为乙腈。
[0025] (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。
[0026] 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1.25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。
[0027] (7)纯化后的生物改性蓖麻蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
[0028]本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。
[0029] (8)赋予不同的药用辅助材料，分别制备成注射剂、口服剂、栓剂，可用于制备抗恶 性胸腺肿瘤药品。
[0030] 本发明的优点和有益效果如下：通过本发明分离纯化的生物改性蓖麻蛋白 质用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为 12. 2~12.SKPa;用等电聚焦发测定其等电点为pH7. 9~9. 2;常规化学法分析结果表明其不 含糖类和磷酸基团；紫外分光光度法分析在260nm和280nm测定纯化的生物改性蓖麻蛋白 质含量为98. 6%;分子结构属非典型、非单一的昆虫蛋白质，链内与链间不含二硫键，其三 级结构构象单元以无规卷曲为主，a螺旋与P折叠的含量比例基本相当。本发明制备的 生物改性蓖麻蛋白质制剂质量稳定，结构清楚，药理明晰，疗效明显，含量可检可测，剂型多 样，成本较低，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0032] 实施例1: (1)将1000 g生物改性蓖麻虫体干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对 膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至〇. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常 压,生物改性蓖麻虫体被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的生物改性蓖麻粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076.6) 中，加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3，H20,加压至2~10MPa，形成 膨胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，生物改性蓖麻粉体中的蛋白质溶解，然 后降压至常压，生成生物改性蓖麻蛋白粗品与甲醇-NH3?H2O的混合液； (3) 收集含有生物改性蓖麻蛋白粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处 固体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的生物改性蓖麻蛋白超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡,用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱,常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm; (7) 纯化后的生物改性蓖麻蛋白用真空冷冻干燥机在温度-30~50°C、时间18~26h干燥 制备成冻干蛋白粉。
[0033] 实施例2: (1)将1000 g生物改性蓖麻虫体干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对 膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至〇. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常 压,生物改性蓖麻虫体被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的生物改性蓖麻粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6) 中，加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ?H2O,加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系， 保持温度15°C，时间20min，生物改性蓖麻粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成生 物改性蓖麻蛋白粗品与甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有生物改性蓖麻蛋白粗品的溶液，用孔径30Mm的微孔过滤器过滤去处固体 杂质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的生物改性蓖麻蛋白超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用1〇~80%的乙腈梯度脱洗，流速 5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率I. 0KW，频率500KHz，流速200mL/ min，紫外检测器波长260nm; (7)纯化后的生物改性蓖麻蛋白用真空冷冻干燥机在温度-30~40°C、时间20h干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0034] 实施例3: (1)将1000 g生物改性蓖麻虫体干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对 膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至〇. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常 压,生物改性蓖麻虫体被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的生物改性蓖麻粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6) 中，加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成 膨胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，生物改性蓖麻粉体中的蛋白质溶解，然 后降压至常压，生成生物改性蓖麻蛋白粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有生物改性蓖麻蛋白粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处 固体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的生物改性蓖麻蛋白超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡,用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱,常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1.25:3.75:5)溶剂体系中， 用超声驻波液相制备色谱（200920274485. 8 )分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外检测器波长 260~280nm; (7) 纯化后的生物改性蓖麻蛋白用真空冷冻干燥机在温度-30~50°C、时间18~26h干燥 制备成冻干蛋白粉。