用于治疗细菌感染的定制脂质体的利记博彩app
【专利说明】用于治疗细菌感染的定制脂质体 发明领域
[0001] 本发明涉及空脂质体或脂质体混合物用于治疗和预防细菌感染的用途和定义脂 质组成的其他脂质双层或单层用于治疗和预防细菌感染的用途。同样，本发明涉及此类细 菌感染的治疗方法，其包括单独或组合标准抗生素治疗施用空脂质体或脂质体混合物。此 夕卜，本发明同样涉及新脂质体混合物。
[0002] 发明背景 细菌感染仍然是人生命的主要威胁之一。由于对甚至最有效的抗生素的细菌耐药性增 力口，所以也必须努力鉴定新型抗菌策略。在其他致病因素中，许多致病细菌分泌毒素，所述 毒素通过干扰真核细胞的质膜杀死真核细胞。细菌成孔毒素在细胞表面上是有活性的，弓丨 起孔形成和质膜破坏，随后宿主靶细胞的裂解或凋亡，然而细菌磷脂酶通过质膜磷脂的酶 促降解而诱导宿主细胞死亡。
[0003] 细菌膜去稳定毒素，诸如胆固醇依赖的溶细胞素（CDCs:肺炎球菌溶血素0、链球 菌溶血素〇、破伤风菌溶血素），α溶血素或细菌磷脂酶（磷脂酶C、鞘磷脂酶）在感染性疾 病的确立和发展中发挥关键作用。此类疾病是肺炎，所有年龄组中死亡的主要原因和低收 入国家中儿童死亡的主要原因；菌血症，感染或外科手术的严重并发症，其特征在于由于脓 毒症和脓毒性休克导致的高死亡率；和脑膜炎，危及生命的疾病，其也导致了严重的长期后 果，诸如耳聋、癫痫、脑积水和认知缺陷。
[0004] 为了靶向宿主细胞，细菌膜去稳定毒素或结合至单个膜脂质（脂质头部基团）或 利用真核细胞的质膜的脂质双层的不均匀性质，与某些脂质种类中富集的微结构域相互作 用（Gonzales M.R.等人，Cell. Mol. LifeSci. 2008，65:493-507)。体内条件不利于双 层内脂质的非均匀分布，因为跨膜蛋白和众多具有可变长度的单个脂质种类的存在以及它 们的酰基链的饱和状况反对脂质去混合，和从而稳定的脂质微结构域的形成（Simons K.和 Gerl E J·，Nat. Rev. Moh CellBioh 2010，11:688-99)。然而，在从有限数量的仔细 选择的脂质种类制备的人工无蛋白脂质体（其中可以生成延长的稳定的脂质微结构域）中 可以尽其极采用脂质去混合（Klose C.等人，J. Biol. Chem. 2010，285:30224-32)。此 夕卜，人工脂质体允许比体内以往可能存在的脂质高得多的相对浓度的特定脂质。因此，可以 产生展示定义生物化学特性的稳定脂质微结构域且具有高相对浓度的特定脂质的脂质体。 脂质体目前在化妆品和制药工业中用作用于局部和全身药物递送的载体，且被认为是无毒 的。
[0005] 发明概述 本发明涉及定义脂质组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物用于治疗 和预防细菌感染，特别是皮肤病变、菌血症、脑膜炎、呼吸道感染诸如肺炎和腹腔感染诸如 腹膜炎的用途。
[0006] 本发明还涉及覆盖非脂质表面的定义脂质组成的脂质双层或脂质单层，其用于治 疗和预防细菌感染。
[0007] 同样，本发明涉及此类细菌感染的治疗方法，其包括向有需要的患者施用治疗有 效量的定义脂质组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物，和预防有风险的受 试者中的此类细菌感染的方法。此外，本发明涉及细菌感染的治疗方法，其包括在细菌感染 的标准抗生素治疗之前、之后、一起或平行地向有需要的患者施用治疗有效量的定义脂质 组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物。
[0008] 此外，本发明涉及定义脂质组成的空脂质体的新混合物。
[0009] 附图简述 图L由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体保护单核细胞免受胆固醇依赖的溶细胞素 、a 溶血素和磷脂酶C的影响。
[0010] A-D)含有胆固醇组合PC (3)、Sm (4)或PS (5)，但不组合PE (6)的脂质体（1:1 w/w混合物）保护THP-I细胞免受胆固醇依赖的溶细胞素：肺炎球菌溶血素0 (A)、链球菌 溶血素0 (B)、破伤风菌溶血素（C)以及磷脂酶C(D)的影响。
[0011] E)含有胆固醇组合Sm (4)，但不组合PC (3)、PS (5)或PE (6)的脂质体（1:1 w/w)保护THP-I细胞免受α溶血素的影响。
[0012] F)无胆固醇的脂质体（7-9)是无效的。
[0013] c (r. U.)=相对于在毒素（2)不存在的情况下维持的细胞数的在毒素（1，3-9) 存在的情况下维持的细胞数以相对单位（r. u.)给出。PLY=肺炎球菌溶血素0 ;SL0=链球菌 溶血素 OJL=破伤风菌溶血素；PLC=磷脂酶C ; HML=Ci溶血素。1=对照（无脂质体）； 2 =对照（无毒素），3= Ch: PC (I: I w/w)脂质体；4= Ch: Sm (I: I w/w)脂质体；5= Ch: PS (1:1 w/w)脂质体；6= Ch:PE (1:1 w/w)脂质体；7= PC:Sm (1:1 w/w)脂质体；8= Sm脂质 体；9= PC脂质体。Ch =胆固醇；PC=磷脂酰胆碱；PS=磷脂酰丝氨酸；Sm =鞘磷脂；PE=磷 脂酰乙醇胺。
[0014] 图2.由胆固醇和鞘磷脂（1:1 w/w)构成的脂质体在微克量保护单核细胞免受胆 固醇依赖的溶细胞素的影响，而对于针对金黄色葡萄球菌a溶血素和产气荚膜梭状芽孢 杆菌磷脂酶C的保护则需要25-100微克的脂质体。
[0015] A)针对0.2微克PLY的保护。B)针对0.4微克SLO的保护。C)针对0.2微克 TL的保护。D)针对1.2微克HML的保护。E)针对4. 5微克PLC的保护。
[0016] c (r.u.)=相对于在毒素不存在的情况下维持的细胞数的在毒素存在的情况下 维持的细胞数，以相对单位给出。X轴：LP (mkg)=脂质体的量（微克）。PLY=肺炎球菌溶 血素0 ;SL0=链球菌溶血素0 ;TL=破伤风菌溶血素；HML= α溶血素；PLC=磷脂酶C。
[0017] 图3.对于由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体需要高于30% (w/w)的浓度的胆固醇 来保护单核细胞免受肺炎球菌溶血素、破伤风菌溶血素或α溶血素的影响。
[0018] A)针对0.2微克PLY的保护。B)针对0.2微克TL的保护。C)针对1.2微克 HML的保护。c (r.u.)=相对于在毒素不存在的情况下维持的细胞数的在毒素存在的情况 下维持的细胞数，以相对单位给出。Ch (%)=由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体中胆固醇的 百分比（w/w)。PLY=肺炎球菌溶血素；TL=破伤风菌溶血素；HML= α溶血素。
[0019] 图4.由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体保护单核细胞免受胆固醇依赖的溶细胞素 和金黄色葡萄球菌α溶血素的组合的影响。
[0020] A) Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体（6)针对α溶血素（HML; 1.2微克）、链球菌溶血素 0 (SL0; 0.4微克）和破伤风菌溶血素（TL; 0.2微克）的联合作用发挥完全保护作用，而 Ch:PC (1:1 w/w)脂质体是无效的（7)。C (r.u.)=相对于在毒素⑴不存在的情况下维 持的对照细胞数的在毒素（2-7)存在的情况下维持的细胞数，以相对单位计。1 =对照（无 毒素）；2 = SLO,无脂质体；3 = TL，无脂质体；4 = HML，无脂质体；5 = SLO+TL+HML，无脂 质体；6 = SLO+TL+HML，Ch:Sm 脂质体；7 = SLO+TL+HML，Ch:PC 脂质体。Ch =胆固醇；PC = 磷脂酰胆碱；Sm =鞘磷脂。
[0021] B)在25微克由Ch: Sm (1:1 w/w)构成的脂质体观察到针对HML (1. 2微克）、SL0 (0.4微克）和TL (0.2微克）的联合作用的完全保护作用。LP (mkg)=脂质体的量（微 克）。
[0022] C)离心实验证实，所有三种毒素直接结合Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体。将毒素与（6) 或不与（2-5) Ch:Sm脂质体预孵育。离心后，将上清液添加至细胞。1 =对照（无毒素）； 2 = SL0,无脂质体；3 = TL，无脂质体；4 = HML，无脂质体；5 = SL0+TL+HML，无脂质体；6 = SLO+TL+HML，Ch: Sm 脂质体。
[0023] 图5.由胆固醇和鞘磷脂（1:1 w/w)构成的脂质体保护单核细胞免受化脓性链球 菌毒素的影响。
[0024] A，B) THP-I细胞在BHI液体培养基存在的情况下增殖（正方形；㈧中虚线）。5 种化脓性链球菌菌株（GAS 1-5 =临床分离株；所有都生长在BHI液体培养基中）的培养上 清液有效地杀死THP-I细胞（三角形），然而，由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体保护细胞免 受链球菌毒素的影响（圆形）。l〇 5c =细胞数X 105。t (d)=治疗后时间（天）。
[0025] C)由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体保护单核细胞免受微克量的化脓性链球菌的 培养上清液的影响。c (%)=相对于在细菌上清液不存在的情况下维持的细胞数（100%)的 在细菌上清液存在的情况下维持的细胞数的百分比。LP (mkg)=脂质体的量（微克）。
[0026] 图6.由胆固醇和鞘磷脂（1:1 w/w)构成的脂质体组合仅鞘磷脂的脂质体完全保 护单核细胞免受肺炎链球菌毒素的影响。
[0027] A，B) THP-I细胞在BHI液体培养基存在的情况下增殖（正方形）。2种肺炎链球 菌菌株（肺炎链球菌1 =临床分离株且肺炎链球菌2 = D39菌株；两者都生长在BHI液体 培养基中）的培养上清液有效地杀死THP-I细胞（三角形），然而，由胆固醇和鞘磷脂（1:1 w/w)构成的脂质体部分保护细胞免受肺炎链球菌毒素的影响（圆形）。IO5C =细胞数X 105。t (d)=治疗后时间（天）。
[0028] C)含有胆固醇的脂质体和不含胆固醇、仅鞘磷脂的脂质体的混合物针对肺炎链 球菌毒素是完全保护的。该图显示由恒定（400 μ g)量的胆固醇：鞘磷脂（1:1 w/w)脂质 体和不同量（〇 - 400 Pg)的仅鞘磷脂的脂质体构成的脂质体混合物的保护作用。
[0029] c (r.u.)=相对于在上清液不存在的情况下维持的细胞数的在细菌上清液存在 的情况下维持的细胞数以相对单位（r.u.)给出。Sm LP (mkg)=仅鞘磷脂的脂质体的量 (微克）。
[0030] 图7.胆固醇：磷脂酰胆碱脂质体（1:1 w/w)和胆固醇：磷脂酰胆碱（1:1 w/w) 和鞘磷脂脂质体的混合物保护单核细胞免受金黄色葡萄球菌菌株MRSA 2040分泌的毒素 的影响。
[0031] THP-I细胞在BHI液体培养基存在的情况下增殖（正方形）。金黄色葡萄球菌（在 BHI液体培养基中生长）的培养上清液在脂质体不存在的情况下有效杀灭THP-I细胞（三 角形）。（A) 900微克（菱形）胆固醇：磷脂酰胆碱（1:1 w/w)脂质体提供针对细菌毒素 的显著保护，而在600微克仅观察到有限的保护（圆形）。（B)对于600微克胆固醇：磷 脂酰胆碱（I: I w/w)脂质体与75微克Sm脂质体的混合物观察到完全保护（菱形）。单独 使用的900微克Sm脂质体是无效的（圆形）。IO 5c =细胞数X 105。t (d)=治疗后时间 (天）