一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疫苗制备领域，具体涉及一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳 米微粒疫苗的方法。
【背景技术】
[0002] 作为一种对动物群体疫病的有效控制手段，动物疫苗技术优化和新型动物疫苗技 术开发得到世界各国相关研宄机构的重视。据统计，到2013年底，我国通过兽药GMP认证 的动物疫苗生产企业有88家，是2000年前疫苗生产企业数量的4倍。动物疫苗市场的巨 大需求是动物疫苗行业发展源动力。长期以来，我国用于动物传染病预防的疫苗大多是传 统疫苗，随着现代生物技术的发展、不同病原致病机理的深入研宄及世界各国对动物性食 品安全性的要求不断提高，传统疫苗制备技术已经不能满足疫苗企业和养殖业发展需求。
[0003] 对于某些原核细胞或真核细胞过量表达的重组蛋白，或者人工合成的用于疫苗制 备的多肽片段，经过纯化或多次沉淀和干燥，蛋白或多肽抗原常常难溶于性质温和的缓冲 液中，蛋白、多肽抗原在未达到疫苗配制所需浓度时便大量析出，这一情况使疫苗制备工艺 一方面使复杂化，限制了疫苗剂型，也增加了疫苗生产成本。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的 方法。
[0005] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0006] 一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其依次包括如下 步骤：
[0007] a.取溶解于生理盐水或PBS缓冲液的抗原液，在相对离心力为7000-10000xg的条 件下离心处理15min，收集沉淀物；
[0008] b.将经过a步骤得到的沉淀物用100?150倍体积（W : V)的生理盐水或PBS 重悬（100-150倍体积（W:V)是指沉淀物的质量（g)与生理盐水或PBS的体积（ml)比为 100-150)，接着搅拌使沉淀物均匀分散；然后在相对离心力为7000-10000 Xg的条件下离心 处理15min，收集沉淀物；将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次；
[0009] c.将经过b步骤得到的沉淀物在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理 15min，收集沉淀物；
[0010] d.接着将C步骤得到的沉淀物重悬于100?150倍体积（W : V)的生理盐水或 PBS中；接着，进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散，得到沉淀物悬液；
[0011] e.将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生 物破碎机的上样容器中，在2?8°C、600?800bar的压力下进行均质，收集第一穿出液；接 着，将第一穿出液在2?8°C、1000?1200bar的压力下进行制粒，重复两次，得到，收集第 二穿出液；
[0012] f.将e步骤收集到的第二穿出液（即疫苗抗原）用生理盐水或PBS调整浓度到 ^ 300 μ g/mL ;
[0013] g.向经过f步骤处理得到的第二穿出液（即疫苗抗原）中加入佐剂，制得疫苗。f 步骤处理得到的第二穿出液（即疫苗抗原）与佐剂进行乳化，制得疫苗。在实践中，可以根 据疫苗制备剂型和佐剂使用说明对乳化方法进行调整。
[0014] 本发明中，优选的方案为在g步骤中：在加入佐剂进行疫苗配制之前，根据《中国 兽药典》附录方法对收集到的第二穿出液（即疫苗抗原）进行无菌检验、内毒素含量检验和 纯度检验，然后将检验合格的第二穿出液中加入佐剂进行疫苗配制。
[0015] 本发明中，优选的方案为还包括步骤h :将g步骤制得的疫苗按照《中国兽药典》附 录方法进行质量检验。
[0016] 本发明中，优选的方案为所述e步骤中的制粒工艺制得的微粒的平均粒径为 20_200nm 〇
[0017] 本发明中，优选的方案为所述a步骤中的抗原液通过如下方法获得：将培养基中 的工程菌进行酶解或机械裂解，离心，分别收集上清液和沉淀；将收集到的沉淀物重悬于 100?150倍体积（W : V)的的TNE-U缓冲液中，在超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超 声10-20min，使沉淀物均匀分散；接着加入体积为培养基体积1/100的TNE-U缓冲液，然 后在温度为4°C的层析柜中振荡30min ;接着离心收集沉淀，所述离心处理的相对离心力为 7000xg、时间为15min ;接着将收集到的沉淀重悬于体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲 液中，超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10-20min，使沉淀物均匀分散；接着加入体 积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液，然后在温度为4°C的层析柜中振荡30min，得到抗 原液；
[0018] 所述TNE-U缓冲液由如下方法制成：将Tris-Base、NaCl、Urea和蒸馏水混合，然 后经过0. 45 μπτ滤器过滤除菌处理，即得；其中Tris-Base的摩尔浓度为0. 5mol/L、NaCl的 摩尔浓度为〇. 25mol/L、Urea的摩尔浓度为2-4mol/L，所述TNE-U缓冲液的pH值为7. 4 ;
[0019] 所述TNE-T缓冲液由如下方法制成：取脱氧胆酸和Triton XlOO的一种，然后 与Tris-Base、NaCl和蒸馏水混合，然后经过0.45μπι滤器过滤除菌处理，即得；其中 Tris-Base的摩尔浓度为0· 5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0· 25mol/L、TritonXlOO的体积百 分数为〇. 1-1 %、脱氧胆酸的质量百分数为5-10%，所述TNE-T缓冲液的pH值为7. 4。
[0020] 本发明中，优选的方案为所述蛋白抗原为在生理溶液中溶解度较低的纯化蛋白或 重组表达后为包涵体形式的蛋白；所述多肽抗原为人工合成、提纯后在生理溶液中难溶多 肽或重组表达后不溶解的多肽物。
[0021] 本发明中，优选的方案为：
[0022] 所述TNE-U缓冲液中Tris-Base的摩尔浓度为0. 5mol/L、NaCl的摩尔浓度为 0· 25mol/L、Urea 的摩尔浓度为 2mol/L，pH 值为 7. 4 ;
[0023] 所述TNE-T缓冲液中Tris-Base的摩尔浓度为0. 5mol/L、NaCl的摩尔浓度为 0· 25mol/L、Triton XlOO的体积百分数为0· 1-1 %、脱氧胆酸的质量百分数为5-10%，pH值 为 7. 4。
[0024] 本发明中，优选的方案为所述a步骤中的相对离心力为lOOOOxg，离心时间为 15min〇
[0025] 本发明中，优选的方案为所述b步骤具体为：将经过a步骤得到的沉淀物重悬于 100?150倍（W : V)沉淀物体积的生理盐水或PBS中，然后在7000r/min的转速下搅拌 15min使沉淀物均勾分散；在相对离心力为IOOOOxg的条件下离心处理15min，收集沉淀物； 将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次。
[0026] 本发明中，优选的方案为所述d步骤具体为：接着将c步骤得到的沉淀物重悬于 100?150倍（W : V)沉淀体积的生理盐水或PBS中；接着，进行冰浴超声处理使沉淀物均 匀分散，得到沉淀物悬液；其中，所述冰浴超声处理的功率为200w、时间为10-20min。
[0027] 本发明中，优选的方案为所述e步骤具体为：将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌 的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在2?8°C、800bar的压力 下进行均质，收集第一穿出液；接着，将第一穿出液在2?8°C、IlOObar的压力下进行制粒， 重复两次，得到，收集第二穿出液（即为疫苗抗原）。
[0028] 本发明中，优选的方案为所述超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声lOmin。
[0029] 与现有技术相比，本发明的优点在于：经过本发明的纯化处理、均质和制粒处理等 工艺，获得一种纯净度高、均质、稳定的蛋白微粒抗原；更重要的是，经此工艺制备的纳米抗 原可选择制备油包水型（W/0)、水包油包水型（W/0/W)和水包油型（Ο/W)疫苗，扩大了疫苗 佐剂可选择范围。应用该工艺制备的纳米级微粒抗原大大简化了此类疫苗生产工艺，缩短 了疫苗生产时间，显著减低疫苗生产成本。微粒化的抗原更有利于吞噬细胞的吞噬及抗原 呈递细胞的活化和将抗原呈递到T细胞等，蛋白或多肽抗原性的有效释放，同时大大降低 了疫苗的抗原使用量。
[0030] 下面结合附图及【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
【附图说明】
[0031] 下面结合附图进一步阐明本发明的实施例。
[0032] 图1为实施例2中的SDS-PAGE方法测试蛋白纯度的电泳图；
[0033] 图2为实施例2中显微镜下的抗原颗粒图；
[0034] 图3为实施例2中显微镜下的抗原粒径分布图；
[0035] 其中，图1中，M、蛋白Marker的泳道；1、为菌体裂解物的泳道；2、TNE-U洗涤后的 沉淀的泳道；3、TNE-T洗涤后的沉淀（最终产物）的泳道；
[0036] 图2中，黑色三角指示的是单个的颗粒，白色三角指示的是聚集的颗粒。
【具体实施方式】 [0037] 实施例1
[0038] 一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，依次包括如下步 骤：
[0039] a.取溶解于生理盐水或PBS缓冲液的抗原液，在相对离心力为7000xg的条件下离 心处理15min，收集沉淀物；
[0040] b.将经过a步骤得到的沉淀物用100?150倍体积（W : V)的生理盐水或PBS重 悬，接着搅拌使沉淀物均匀分散；然后在相对离心力为7000Xg的条件下离心处理15min，收 集沉淀物；将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次；
[0041] c.将经过b步骤得到的沉淀物在相对离心力为7000xg的条件下离心处理15min， 收集沉淀物；
[0042] d.接着将c步骤得到的沉淀物重悬于100倍体积（W : V)的生理盐水或PBS中； 接着，进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散，得到沉淀物悬液；
[0043] e.将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物 破碎机的上样容器中，在5°C、800bar的压力下进行均质，收集第一穿出液；接着，将第一穿 出液在5°C、1100bar的压力下进行制粒，重复两次，得到，收集第二穿出液；
[0044] f.将e步骤收集到的第二穿出液（即疫苗抗原）用生理盐水或PBS调整浓度到 ^ 300 μ g/mL ;
[0045] g.向经过f步骤处理得到的第二穿出液（即疫苗抗原）中加入佐剂，制得疫苗。f 步骤处理得到的第二穿出液（即疫苗抗原）与佐剂进行乳化，制得疫苗；
[0046] 所述a步骤中的抗原液通过如下方法骤获得：将培养基中的PCV2Cap_pET21 / Rosetta种子菌进行机械破碎，离心，分别收集上清液和沉淀。