用于针对金黄色葡萄球菌的免疫的稳定化的蛋白质的利记博彩app
【专利说明】
[0001] 本申请要求2012年8月31日提交的美国临时申请61/695, 759的权益，其全部内 容通过引用纳入本文W用于所有目的。
技术领域
[0002] 本发明涉及包含衍生自金黄色葡萄球菌（Staphylococ州S aureus)的抗原的免疫 原性组合物及其在免疫中的用途。
【背景技术】
[0003] 金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性球菌，并且是血流、下呼吸道和皮肤W及其他 软组织感染的主要原因。其导致从轻度皮肤感染到致命性疾病（包括肺炎和败血症）的多 种疾病，且在美国每年与金黄色葡萄球菌相关的死亡率超过了任意其他感染性疾病（包括 HIV/AID 巧。
[0004] 目前没有批准的针对金黄色葡萄球菌的疫苗。在2005年的III期临床试验中，与 安慰剂组相比，基于来自5型和8型细菌的表面多糖混合物的疫苗StaphVAX?无法减少感 染。参考文献1报道了来自默克公司（Merck)和因特塞尔公司（Intercell)的"V710"疫苗 的数据，该疫苗基于单个抗原Is地，该是一种保守的馨合铁的细胞表面蛋白巧，3]。然而， V710的临床试验在2011年终止，其依据是观察到V710不可能表现出统计学上显著的临床 益处，且与安慰剂接受者相比，在疫苗接受者中出现了更高频率的关于总体死亡率和多器 官功能障碍的安全问题[4]。
[0005] 参考文献5公开了作为疫苗策略的多种金黄色葡萄球菌抗原及其组合。参考文献 6公开了金黄色葡萄球菌多肤抗原在简单的缓冲溶液中可能不稳定并可通过稳定化添加剂 (如邸TA)的存在来稳定抗原。抗原的不稳定性是不希望的，因为（1)该使得疫苗无法在给 予前长时间储存，W及（2)各批次间疫苗的不一致性会影响质量和管理机构批准的要求。 此外，含有该些不稳定抗原的疫苗的生产会变得复杂且涉及多个纯化步骤。因此，本发明的 一个目标是鉴定用于在免疫原性组合物中稳定金黄色葡萄球菌多肤抗原的其他策略。
【发明内容】
[0006] 发明人发现，防止抗原的寡聚化是增强抗原稳定性的有效策略。多种金黄色葡萄 球菌抗原含有半脫氨酸残基，且它们在标准缓冲溶液中可形成寡聚体，包括由半脫氨酸残 基之间的二硫键形成的共价二聚体。发明人发现，含有该些共价二聚体的组合物可能是不 稳定的，并且可形成聚集体或影响组合物中其他抗原（如果存在）的稳定性。可通过取代、 修饰或删除半脫氨酸残基从而使二硫键无法形成的方式防止共价二聚体的形成。有趣的 是，防止该些抗原形成共价二聚体提高了抗原稳定性并维持了组合物的高总体选择性（即 相对于总体抗原存在高比例的单个同种型）和纯度。此外，发明人发现，该些半脫氨酸缺陷 型抗原在引发针对野生型含半脫氨酸抗原的免疫应答中仍是有效的。因此，可在疫苗制剂 中包含半脫氨酸缺陷型抗原W提高抗原稳定性。
[0007] 天然状态下StaO 11抗原在其成熟形式中具有N端半脫氨酸。StaO 11形成各批次间 比例变化的二聚体和蛋白同种型（pi为6. 0、7. 8和8. 0)。发明人发现，删除半脫氨酸停止 了单个同种型（pi 8.0)的二聚化并生成较易于表征和分析的蛋白，而不对免疫原性产生 负面影响。因此，本发明提供了一种氨基酸序列与SEQ ID N0:7具有至少90% (例如大于 等于91 %、大于等于92%、大于等于93%、大于等于94%、大于等于95%、大于等于96%、 大于等于97%、大于等于98%、大于等于99%、大于等于99. 5%)相同性的多化该多肤没 有游离的琉基且能够引发（例如在给予人时）识别野生型StaOll抗原（例如由氨基酸序 列SEQ ID N0:5组成的金黄色葡萄球菌蛋白）的抗体。该多肤不能通过二硫键形成共价二 聚体。
[0008] 本发明提供一种包含本发明的多肤的免疫原性组合物。该组合物可W是水性形 式，此时理想情况下其抑为5至8。该组合物还可包括佐剂，例如铅盐。
[0009] 在本发明的一些实施方式中，该免疫原性组合物还包含其他抗原，该抗原可W是 多肤和/或糖。例如，其还可包括一种或多种金黄色葡萄球菌芙膜糖偶联物，例如针对血清 型5和/或血清型8菌株。在其他实施方式中，该组合物不包含其他葡萄球菌多肤抗原。在 其他实施方式中，该组合物不包括其他葡萄球菌抗原。在另一个实施方式中，该组合物不包 含其他抗原。
[0010] 本发明还提供了本发明的免疫原性组合物的冻干物。该冻干物可使用水性材料重 建W提供水性的本发明的免疫原性组合物。为进行给药，对冻干物使用合适的液体稀释剂 (例如缓冲液、盐水溶液、用于注射的水（WFI))重建。该液体稀释剂可包括佐剂，例如铅盐 或水包油乳液佐剂。
[0011] StaOll
[0012] "StaOll"抗原作为有用的免疫原公开于参考文献5中。其最初仅被标注为 "脂蛋白"。在NCTC 8325菌株中，StaOll是SA0UHSC_00052且具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1佑1:88193872)。已知的StaOll抗原在其可被脂化的成熟形式中具有N末端半脫氨酸。 野生型含半脫氨酸的StaOll可W单体或寡聚体（例如共价二聚体）的形式存在，具有Ca++ 离子有利的寡聚化。
[0013] 本发明使用不能通过二硫键形成共价二聚体的StaOll的变体形式。该多肤不含 任何游离的琉基（在还原条件下）。其能够引发识别野生型StaOll抗原（例如SEQ ID NO:5、13、14或15)的抗体（例如在给予人时）。该多肤可包含与SEQ ID NO:7-12中任一 条序列具有 80%或更高（例如 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、99. 5%或更高）相同性的氨基酸序列。
[0014] 569 10側:7是569 10側：1的氨基酸残基26-256。与569 10側:7相比，569 10 N0:8在N末端具有额外的氨基酸残基"X"，其中"X"是不含游离琉基的氨基酸（例如，Ser =SEQ ID NO: 12)。SEQ ID NO:9 具有 SEQ ID N0:7 的 N 末端处的 Met-Gl厂序列。SEQ ID NO: 10 具有 SEQ ID N0:8 的 N 末端处的 Met-Gl厂序列。SEQ ID NO: 11 具有 SEQ ID NO: 10 的序列，其中"X"是丝氨酸。包含SEQ ID N0:7-12中任一条序列的StaOll多肤可用于本 发明。
[0015] 可用于制备本发明的StaOll多肤的SEQ ID NO: 1的变体形式包括但不限于具有 各种116/^31/1611取代的569 10側:2、3和4。与569 10側：1相比，569 10側:2具有 Leu-146 取代 Ile-146,并具有 Ile-165 取代 Leu-165。与 SEQ ID N0:1 相比，SEQ ID N0:3 具有 Va^l46 取代 Ile-146,并具有 Ile-165 取代 Leu-165。与 SEQ ID N0:1 相比，SEQ ID N0:4具有Leu-146取代Ile-146,并具有Varies取代Leu-165。可有利地省略SEQ ID N0:l-4的前23个N末端氨基酸（即信号肤）W分别得到SEQ ID N0:5、13、14和15。因 此，本发明的StaOll多肤可包含SEQ ID NO: 1-4中任一条的残基26-256,并且其可引发识 别成熟StaOll抗原（例如，SEQ ID N0:5、13、14或15)的抗体（例如在给予人时）。
[0016] 有用的StaOll变体形式可包含至少一个点突变，该点突变取代、修饰或删除了抗 原的野生型形式中存在的半脫氨酸残基。例如，StaOll多肤可包含具有SEQ ID N0:6的氨 基酸序列，其中取代、修饰或删除SEQ ID N0:6第3位上的半脫氨酸残基。优选地，用丝氨酸 残基（例如，得到SEQ ID NO: 11)或丙氨酸残基来进行该取代。或者，删除半脫氨酸残基。
[0017] 杂交多肤
[001引本发明所用的抗原可W单独多肤的形式存在于组合物中。然而，使用一种W上抗 原时，它们不必W单独多肤的形式存在。相反，至少两种（如2、3、4、5或更多种）抗原可表 达成一条多肤链（"杂交"多肤），如参考文献5中所述。理想情况下，本发明所用的杂交多 肤不含游离的琉基（在还原条件下）。
[0019] 由两种、H种、四种或更多种抗原的氨基酸序列组成的杂交体是有用的。具体地， 优选由两种、H种、四种或五种抗原（如两种抗原）的氨基酸序列组成的杂交体。
[0020] 不同的杂交多肤可W在单一制剂中混合在一起。如本文他处所述，杂交多肤也可 与偶联物或非金黄色葡萄球菌抗原组合。
[0021] 有用的是，该些杂交多肤可引发抗体（例如给予人时），该抗体识别杂交体中存在 的各野生型葡萄球菌蛋白。
[0022] 在一些实施方式中，单个杂交多肤中的抗原通过接头氨基酸序列连接在一起。接 头氨基酸序列一般较短（如20个或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8、7、6、5、4