作为疫苗的艰难梭菌多肽的利记博彩app
【技术领域】
[OOOU 本发明设及来源于艰难梭菌杞difficile)的多肤，特别是使用该多肤治疗和预 防艰难梭菌感染的方法。
【背景技术】
[0002] 艰难梭菌是一种革兰氏阳性、杆状、厌氧产抱子细菌。第一个完全测序的艰难梭菌 基因组公开于2006年[1]，并鉴定到了 3776个预测的编码序列。艰难梭菌是肠道菌群的常 见组分，在没有疾病迹象的情况下估计占总群体的3%。在肠道菌群的天然平衡受到干扰 时，艰难梭菌会变得更为普遍。该过度生长导致细菌开始在群体信号调节因子的控制下生 产毒素。干扰肠道菌群天然平衡的最常见原因是给予了有害于一些肠道细菌但不影响艰难 梭菌的抗生素。艰难梭菌是抗生素相关腹泻（AAD)的主要原因，但症状可发展至威胁生命 的伪膜性肠炎。在老年住院患者中感染的流行程度最高，但在非典型组（如青少年和妊娠 女性）中感染逐渐增多巧]。已观察到那些艰难梭菌感染者中有12%至35%在2个月内复 发巧]。
[0003] 在20世纪70年代，艰难梭菌仅被鉴定为AAD的致病物。从那W后，尝试了多种用 于对抗感染的策略。特定的抗生素（如万古霉素、甲硝挫、硝挫巧特、杆菌肤或梭链抱酸） 最初被用于治疗艰难梭菌感染，并且沿用至今（参见参考文献4、5和6)。但是，使用该些抗 生素进行广泛治疗是不利的，因为艰难梭菌存在风险，也因为随着时间推移，其他肠道细菌 也变得耐药。最近，已适用基于细菌分泌的类毒素的疫苗和祀向该类毒素的被动免疫治疗 来进行治疗。在18-85岁患者的II期试验中测试了含和不含佐剂的类毒素疫苗W确定在 给予第=次剂量的该疫苗后9周时该疫苗预防复发性CDI的效力。类毒素疫苗通常需要重 复给药和佐剂W引发免疫应答。此外，其给药通常与注射位点免疫反应相关。然而，基于毒 素的疫苗仅预防毒素结合，中和炎性作用；该类疫苗通常不能完全预防建群或从身体中清 除存在的病原体。例如，抱子可能剩余，该表明可能发生具有相关症状的进一步感染或感染 复发。
[0004] 因此，需要改善的用于治疗或预防艰难梭菌感染的组合物和方法。具体而言，需要 可用作疫苗组分并可用于在疫苗接种对象中限制或消除建群（包括抱子）W进一步预防艰 难梭菌传递的多肤。本发明的目的是提供能够有效产生针对艰难梭菌的免疫应答的多肤和 组合物，其用于研发预防和/或治疗艰难梭菌相关疾病的疫苗。
[0005] 图1 ;提供了各经选择多肤的概要信息，包括内部名称、基因标识符佑1)、基因座 标记、氨基酸序列长度（AA)、最初从中分离出多肤的菌株标识名称、对应于各多肤的SEQ ID NO、克隆的多肤和多个引物的SEQ ID NO。
[0006] 图2 ;总结了分泌组、NMR和共聚焦显微实验的结果。
[0007] 图3 ;提供了 NMR分析中所用方法的示意图。
[000引 图 4 ;Diff44 的 15N-服CQ 谱
[0009] 图5 ;显示了通过Western印迹进行的表面暴露研究的结果
[0010] 图6 ;提供了 Dif232的代表性FACS数据
[0011] 图7 ;提供了设及细胞结合实验的数据总结。通过FACS分析进行的人Vero细胞 上重组多肤和通过共聚焦显微分析进行的人Vero和化CO-2细胞上重组多肤的结合试验
[0012] 图8 ;采用抗Difl92和抗Dif44抗体对艰难梭菌参考菌株化30、R20291和M120) 的总细胞提取物和代表不同PCR核糖体型的临床分离物进行的Western印迹分析。Difl92 成熟形式是647aa和71. IkDa。Dif44成熟形式是286aa和31kDa。
[001引图9 ;提供了设及ELISA结合试验的结果总结
[0014] 图10 ;通过Western印迹，对艰难梭菌重组多肤（10化g)进行识别，（A)仓鼠的血 清，使用毒素A和B联合疫苗接种并使用艰难梭菌630菌株或B1菌株攻击的仓鼠的血清， 炬）未感染的仓鼠的血清。
[0015] 图11 ;人血清抗体对艰难梭菌重组多肤的识别。
[0016] 图12 ;人血清抗体对艰难梭菌重组多肤的识别。
[0017] 图13 ;人血清抗体对艰难梭菌重组多肤的识别。
[0018] 图14 ;小鼠血清抗体对艰难梭菌重组多肤的识别。使用由浓缩的上清液巧） Difl83(CD3669)免疫的小鼠的血清对重组蛋白进行免疫印迹。
[0019] 图15 ;Difl53和炭痘热致死因子的C端（残基589-810)之间的比对；Difl53与 炭痘热致死因子的C端同源；与PA相互作用所必需的N端结构域缺失；催化位点（肥XXH) 是保守的。
[0020] 图16 ;巧光测定试验显示在锋存在的情况下Difl53的明胶酶/胶原酶活性较弱。
[0021] 图17 ;含量递减的重组Difl53与同一量的所需底物（胶原I-VI，纤连蛋白）解 育。该反应在〇,5mMZnC12存在的条件下在37°C下进行16小时。将反应产物加载到凝胶 上用于SDS-PAGE，随后使用银或考马斯染色。
[0022] 图 18 ;Difl83 含有 GerMN 结构域。
[002引 图19 ; (A)使用抗Difl83血清对菌株630细胞组分进行的Western印迹分析；炬） 对菌株630营养细胞的免疫巧光分析。
[0024] 图20 ;通过Western印迹分析培养物上清组分中是否存在Difl83。
[0025] 图21 ;Difl83缺失突变体具有抱子形成/萌发表型。
[0026] 图22 ;优选的艰难梭菌重组毒素片段的示意图。邸=酶结构域；GT =葡糖基转移 酶结构域；CP =半脱氨酸蛋白酶结构域；T -易位结构域巧=结合结构域。所有结构域都 是可溶的，不同之处在于TcdA的T4和PTA2结构域是不可溶的。
[0027] 图23 ;显示了给予具有Dif44或Dif208的毒素片段抗原并随后进行艰难梭菌630 攻击后，经疫苗接种的动物的温度波动。
[002引图24 ;显示了使用毒素片段抗原联合Dif44或Dif208进行疫苗接种的动物中，在 艰难梭菌攻击后收集的粪粒中观察到的艰难梭菌数目（CPU/lOOmg)。
[0029] 图25 ;显示了对于使用毒素片段抗原联合Dif44或Dif208进行疫苗接种并随后 进行艰难梭菌630攻击的动物，在实验终点时盲肠腔（Cae-LA)、结肠腔（Co^LA)、盲肠组织 (化e-TA)和结肠组织（Co^TA)中艰难梭菌的数目。
[0030] 图26 ;显示了所有经疫苗接种的组在实验终点（攻击后第14天）时分离的艰难 梭菌总数。
[003U 图27 ;显示了实验终点时肠道样品中的毒素效价。
[003引图28 ;显示了来自实施例15的仓鼠1-5的（A)血清或做结肠和直肠洗出物对 重组 ToxAp5_6、ToxB_GT 和 Dif44 的识别。
[003引 图29 ;显示了来自实施例15的仓鼠6-10的（A)血清或做结肠和直肠洗出物对 重组 ToxAp5_6、ToxB_GT 和 Dif208 的识别。
[0034] 图30 ;显示了来自实施例15的仓鼠1-5的血清对各种细胞壁蛋白（CWP)的识别。
【发明内容】
[0035] 本发明提供了包含选自下组的氨基酸序列的多肤；SEQ ID NO 79、81、93、105、 111、113、125、133, 139、141、153、165、171、173, 185、187、189、300、322、357、359、361、433、 435, 437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463 和 465。所述多肤已 经鉴定来自艰难梭菌。具体地，本发明的多肤具有免疫原性且适用于免疫原性组合物，例如 疫苗组合物。
[0036] 在一个实施方式中，本发明的多肤总结于下文W及图1中。
[0037] Dif44 ;该蛋白质也称为"CD0844"并标注为来自艰难梭菌的细胞表面蛋白cwp25。 该多肤的核酸序列和氨基酸序列分别对应于SEQ ID N0:78和138 W及SEQ ID N0:79和 139中所列序列。
[0038] Di巧1 ;该蛋白质也称为"CD0999"并标注为来自艰难梭菌的ABC转运蛋白底物结 合蛋白脂蛋白。该多肤的核酸序列和氨基酸序列分别对应于SEQ ID N0:80和140W及SEQ ID N0:81和141中所列序列。N端半脱氨酸缺失的该多肤的核酸序列和氨基酸序列分别对 应于SEQ ID NO:356和357所示序列。
[0039] Difl30 ;该蛋白质也称为"CD2645"并标注为推定的来自艰难梭菌的胞外溶质结 合蛋白。该多肤的核酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID N0:92和152W及SEQ ID N0:93 和153。N端半脱氨酸缺失的该多肤的核酸序列和氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO: 358