一种含融合蛋白ctt3h的结核病亚单位疫苗及疫苗佐剂的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种含融合蛋白CTT3H的结核病亚单 位疫苗及佐剂。
【背景技术】
[0002] 作为目前全球范围唯一预防结核病的疫苗，卡介苗（BCG)能够有效的预防婴幼儿 重症结核病如粟粒样结核病及结核性脑膜炎，但对于预防成人肺结核病的发生、发展的效 果非常有限。因此，急需发展一种合适的BCG初免后的增强疫苗，以提高其对成人结核病的 预防效果。
[0003] 除此而外，BCG不适用于免疫力低下的人群，如HIV感染等免疫缺陷人群接种BCG 后，反而引起死亡率的升高；BCG初免婴儿后，成年阶段再次免疫BCG，增强免疫的效果有 限，在临床上推荐仅免疫接种一次BCG。因此，采用异源性疫苗一一亚单位疫苗来增强BCG 免疫的效果，对于成人肺结核病的预防具有重要意义和实践价值。因为成分明确、安全稳 定，便于生产，结核病亚单位疫苗在结核病疫苗研制上受到广泛重视。但是，目前已知的结 核病亚单位疫苗仍然存在免疫应答效果不理想的问题，主要受限于可供选择的抗原种类有 限和缺乏适宜的能够刺激T细胞免疫应答的佐剂。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种含融合蛋白CTT3H的结 核病亚单位疫苗，其目的在于通过选择抗原基因和融合顺序制造出融合蛋白，配合本发明 提供的疫苗佐剂，用于预防和治疗结核病，由此解决BCG对于预防成人肺结核病的发生、发 展的效果有限；不适用于免疫力低下的人群，如HIV感染等免疫缺陷人群接种BCG后，反而 引起死亡率的升高；BCG初免后再次注射，增强免疫的效果有限等技术问题。
[0005] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种结核病亚单位疫苗，含有融 合蛋白CTT3H，其浓度为0. lmg/ml至lmg/ml，所述融合蛋白CTT3H其编码基因为CFP10、 TBKX 4、TB8. 4、Rv3615c 以及 HBHA 基因按照 CFP10-TB10. 4-TB8. 4-Rv3615c-HBHA 的顺序串 联。。
[0006] 优选地，所述结核病亚单位疫苗，其所述融合蛋白CTT3H的序列为：
[0007] (1)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
[0008] (2)与序列SEQ ID No. 1限定的氨基酸序列同源性在80%至100%编码相同功能 蛋白质的氨基酸序列；或
[0009] (3) SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同 等活性的由（1)衍生的蛋白。
[0010] 优选地，所述结核病亚单位疫苗，其或含有0. 2mg/ml至0. 3mg/ml单磷酰脂质A、 0· 2mg/ml至0· 3mg/ml的海藻糖、体积分数1%至4%的角藍稀油、体积分数1%至4%的司 盘85、体积分数0· 1 %至0· 4%的吐温-80、以及5mg/ml至20mg/ml热灭活的牡牛分枝杆菌， 为油包水样溶液。所述海藻糖优选6,6' -二分枝菌酸。
[0011] 优选地，所述结核病亚单位疫苗，其或含有lmg/ml至4mg/ml二甲基双十八烧基 按、以及5mg/ml至20mg/ml热灭活的牡牛分枝杆菌，为脂质体形式。
[0012] 优选地，所述结核病亚单位疫苗，其或含有lmg/ml至4mg/ml二甲基双十八烧基 按、0· 2mg/ml至0· 3mg/ml单磷酰脂质A、以及0· 2mg/ml至0· 3mg/ml的海藻糖，为脂质体形 式。所述海藻糖优选6, 6'-二分枝菌酸。
[0013] 按照本发明的另一方面，提供了一种疫苗佐剂，含有0. 4mg/ml至0. 6mg/ml单磷酰 脂质八、0.411^/1]11至0.611^/1]11的海藻糖、体积分数2%至8%的角藍稀油、体积分数2%至 8%的司盘85、体积分数0.2%至0.8%的吐温-80、以及1〇11^/1]11至4〇11^/1]11热灭活的牡牛 分枝杆菌，为油包水样溶液。
[0014] 优选地，所述疫苗佐剂，其所述海藻糖为6, 6' -二分枝菌酸。
[0015] 按照本发明的另一方面，提供了一种疫苗佐剂，含有2mg/ml至8mg/ml二甲基双 十八烧基按、以及l〇mg/ml至40mg/ml热灭活的牡牛分枝杆菌，为脂质体形式。
[0016] 按照本发明的另一方面，提供了一种疫苗佐剂，含有2mg/ml至8mg/ml二甲基双 十八烧基按、0. 4mg/ml至0. 6mg/ml单磷酰脂质A、以及0. 4mg/ml至0. 6mg/ml的海藻糖，为 脂质体形式。
[0017] 优选地，所述疫苗佐剂，其所述海藻糖为6, 6' -二分枝菌酸。总体而言，通过本发 明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于筛选特定的抗原，并按照一定的顺序进行 表达，制备的融合蛋白能有效产生抗原特异的THl型免疫应答，配合本发明提供红的佐剂 能够取得更好的免疫应答效果。同时相对于现有的卡介苗，具有良好的安全性。能够取得 下列增强机体抗结核免疫反应的有益效果。
【附图说明】
[0018] 图1为实施例2的融合蛋白CTT3H的构建、表达纯化和鉴定结果图；
[0019] 图2为实施例15的不同组小鼠血清CTT3H特异的IgG抗体、亚类及IgG2a/IgGl 比值结果图；
[0020] 图3为实施例15的特异的小鼠脾细胞上清中细胞因子IFN- γ和TNF- α的水平 结果图，其中一代表 ρ〈0· 05, * 代表 ρ〈0· 05, vs. PBS control ;
[0021] 图4为实施例15的流式检测融合蛋白CTT3H和PH)特异的C57BL/6小鼠脾细胞 总细胞因子反应结果图，其中一代表Ρ〈〇· 05，*代表ρ〈0· 05, vs. PBS control ;
[0022] 图5为实施例15的流式检测融合蛋白CTT3H和PH)特异的C57BL/6小鼠脾细胞 多功能T细胞结果图，其中一代表ρ〈0· 05, *代表ρ〈0· 05, vs. PBS control ;
[0023] 图6为实施例15的流式检测体内细胞毒性T淋巴细胞的杀伤活性结果图；
[0024] 图7为实施例16的气溶胶攻击感染免疫C57BL/6小鼠四周后的脾、肺脏荷菌量以 及肺脏的组织病理学结果图；其中图7A、图7B分别为气溶胶攻击感染免疫C57BL/6小鼠四 周后的肺脏、脾脏荷菌量；图7C为各组的肺脏病理评分；图7D为各组肺脏的组织病理学显 微照片，其中HE-代表l〇〇um，AFS-代表50um，箭头代表AFS阳性细菌。
【具体实施方式】
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0026] 本发明提供的结核病亚单位疫苗，含有融合蛋白CTT3H，其浓度为0. lmg/ml至 lmg/ml，还含有以下三组成分中的一组的：（1)0. 2mg/ml至0. 3mg/ml单磷酰脂质A(英文 缩写为MPL,后同）、0. 2mg/ml至0. 3mg/ml的海藻糖（英文缩写为TDB,后同）、体积分数 1 %至4%的角鲨烯油、体积分数1 %至4%的司盘85、体积分数0. 1 %至0. 4%的吐温-80、 以及5mg/ml至20mg/ml热灭活的牡牛分枝杆菌（英文缩写为MV，后同），为油包水样溶 液；（2) lmg/ml至4mg/ml二甲基双十八烧基按（英文缩写为DDA，后同）、以及5mg/ml至 20mg/ml热灭活的牡牛分枝杆菌，为脂质体形式；（3) lmg/ml至4mg/ml二甲基双十八烧基 按、0· 2mg/ml至0· 3mg/ml单磷酰脂质A、以及0· 2mg/ml至0· 3mg/ml的海藻糖，为脂质体形 式。所述海藻糖为人工合成的6, 6'-二分枝菌酸。
[0027] 所述融合蛋白CTT3H其编码基因为CFP10、TB10. 4、TB8. 4、Rv3615c以及HBHA基 因按照 CFP10-TB10. 4-TB8. 4-Rv3615c-HBHA 的顺序串联。
[0028] 所述融合蛋白CTT3H的序列为：
[0029] (1)由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
[0030] (2)与序列SEQ ID No. 1限定的氨基酸序列同源性在80%至100%编码相同功能 蛋白质的氨基酸序列；或
[0031] (3) SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经增加、确实或替换一个或多个氨基酸具有同 等活性的由（1)衍生的蛋白。
[0032] 本发明提供的三种疫苗佐剂，分别命名为MTO/MV，DDA/MV和DMT。
[0033] MT0/MV 疫苗佐剂含有 0. 4mg/ml 至 0. 6mg/ml 单磷酰脂质 A、0. 4mg/ml 至 0. 6mg/ml 的海藻糖、体积分数2%至8%的角鲨烯油、体积分数2%至8%的司盘85、体积分数0. 2% 至0.8%的吐温-80、以及1〇11^/1]11至4〇11^/1]11热灭活的牡牛分枝杆菌，为油包水样溶液。所 述海藻糖为人工合成的6, 6' -二分枝菌酸。
[0034] DDA/MV疫苗佐剂含有2mg/ml至8mg/ml二甲基双十八烧基按、以及10mg/ml至 40mg/ml热灭活的牡牛分枝杆菌，为脂质体形式。
[0035] DMT疫苗佐剂含有2mg/ml至8mg/ml二甲基双十八烧基按、0. 4mg/ml至0. 6mg/ml 单磷酰脂质A、以及0. 4mg/ml至0. 6mg/ml的海藻糖，为脂质体形式。所述海藻糖为人工合 成的6, 6' -二分枝菌酸。
[0036] 由于新治疗策略的推广，全球结核病的总报告病例数从2005以来处于持续下降 的趋势。然而，结核病仍然是最严重的感染性疾病之一。每年仍有860万新发病例并且全 球1/3的人口潜伏感染结核分枝杆菌。虽然BCG仍是临床上预防结核病的唯一疫苗，并且 已经使用90多年了，但对成人结核病的保护性在不同地区不同人群中体现出不稳定性，缺 乏预防结核分枝杆菌潜伏感染的能力。因而需要发展新的可用的疫苗来控制结核病。
[0037] 结核病亚单位蛋白候选疫苗，可用来替代BCG或作为增强疫苗增强BCG免疫后的 效应，是新发展的控制结核病的主要疫苗类型之一。而且，亚单位疫苗应用于免疫缺陷人群 相对于BCG更为安全。另外，多结核抗原