一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高分子材料科学领域制备复合生物医药材料的技术，更具体来说，涉 及一种载酶壳聚糖纳米颗粒的制备及应用。
【背景技术】
[0002] 近几十年来，化疗在肿瘤的治疗中取得了重大进展，并已成为目前恶性肿瘤治疗 的一种基本手段，从而使得患者的生存时间明显延长。但是现有的一些化疗药物在给药的 过程中，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会极大地损伤人体正常细胞，因而在治疗中会出现明显 的毒副作用而影响药物的疗效，并给患者带来极大的痛苦。因此，药物载体在肿瘤治疗中具 有明显的优势，特别是纳米给药系统已成为国内外研宄的热点，也是给药系统中发展较快 的领域。
[0003] 纳米给药系统具有增加药物溶解度、提高药物生物利用度、降低药物毒副作用和 延缓释放的理化和生物优势，因而具有广阔的应用前景。生物相容性好、可降解以及对组织 和细胞没有毒副作用的生物新材料一直是生物医学与材料科学研宄的热点。伴随着纳米给 药系统的发展，生物高分子材料也得到飞速发展，特别是基于壳聚糖（Chitosan)的新型生 物载体得到长足发展和应用。
[0004] 壳聚糖（Chitosan)是甲壳素脱乙酰化的衍生物，是自然界中含量仅次于纤维素 的第二大有机高分子化合物，也是自然界中唯一的碱性多糖。它富含大量的可修饰基团，如 氨基、羟基、乙酰胺基以及β (1 - 4)糖苷键，此外，它还具有良好的生物相容性、生物降解 性、亲水性以及可再生性和抗菌性。因而，基于壳聚糖纳米颗粒药物载体系统的制备及其应 用研宄已成为材料科学、生物医学交叉学科研宄的热点，也必将为药物载体的选择和研宄 提供新的机遇。
[0005] 然而，壳聚糖纳米颗粒（CS-NPs)制备过程中多种实验变量又会影响到其制备的 过程，且不同的应用领域对壳聚糖纳米颗粒的粒径、表面电势以及多分散性又有不同的要 求，使得壳聚糖纳米颗粒的应用受到极大的限制。另外壳聚糖纳米颗粒（CS-NPs)的分散性 也是阻碍其应用的一个极大障碍，以往报道的很多纳米颗粒的粒度分布较宽，并且颗粒呈 现多分散性，这极大地不利于其作为药物及基因等的载体。
[0006] 近年来，随着遗传学、免疫学及分子生物学等学科的飞速发展，针对肿瘤的治疗研 宄已由细胞毒性药物向新型抗肿瘤药物发展，特别是植物激素在肿瘤治疗中的作用。已有 研宄发现植物中提取的吲哚-3-乙酸（IAA)作为一种植物激素具有调节植物细胞分裂、分 化和生长过程的作用。而辣根过氧化物酶（HRP)是一种含有激素的植物过氧化物酶，可氧 化包括吲哚-3-乙酸（IAA)在内的一系列底物，产生具有肿瘤治疗作用的化学毒素，可作为 一种新的肿瘤治疗药物。吲哚-3-乙酸（IAA)单独存在于人体内时具有很高的耐受性，不 易被人体内的一系列过氧化物酶所氧化，而只有在辣根过氧化物酶（HRP)存在时才会使其 氧化产生有毒的代谢物，对肿瘤具有毒性作用。但是，辣根过氧化物酶（HRP)在给药的过程 中存在传递效率低、对细胞内蛋白酶抵抗力差和极易被降解的问题。
[0007] 针对壳聚糖纳米颗粒（CS-NPs)应用中存在的粒度分布宽、分散性差的问题，我们 根据研宄和应用的需要，方便且有针对性的通过特定实验变量的考察，利用单因素和正交 优化实验制备出了单分散性良好，并且载酶率高的壳聚糖纳米颗粒。
【发明内容】
[0008] 本发明的第一个目的在于提供一种用于酶-前药疗法的稳定性好、生物相容性 好、载药量大以及酶包裹效率高的载酶壳聚糖纳米颗粒的制备方法。
[0009] 本发明的第二个目的在于提供一种用于酶-前药疗法的稳定性好、生物相容性 好、载药量大以及酶包裹效率高的载酶壳聚糖纳米颗粒。
[0010] 本发明的第三个目的在于提供载酶壳聚糖纳米颗粒在制备酶-前药疗法药物中 的应用。
[0011] 本发明的第四个目的在于提供载酶壳聚糖纳米颗粒与前药吲哚-3-乙酸在制备 治疗乳腺癌联合用药物中的应用。
[0012] 为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种载酶壳聚糖纳米颗粒 的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0013] (1)通过化学交联的方法制成壳聚糖与酶的交联复合体，所述酶是指等电点大于 5的酶，所述等电点大于5的酶是指辣根过氧化物酶、溶菌酶、过氧化氢酶和脂肪酶；
[0014] (2)通过离子凝胶法制备纳米颗粒，将步骤（1)获得的交联复合体于磁力搅拌器 上搅拌，再逐滴加入三聚磷酸钠，待反应后溶液呈均一的乳光悬液，再经多次离心洗涤后得 到纯净的载酶壳聚糖纳米颗粒。
[0015] 作为一个优选方案，所述酶是指辣根过氧化物酶。
[0016] 作为一个优选方案，步骤（1)中所述壳聚糖分子量为5000-10000,脱乙酰度大于 90 %，壳聚糖先溶于1 %的醋酸溶液，待完全溶解后调节pH在5. 0左右，再进行后续化学交 联反应。
[0017] 作为一个优选方案，步骤（1)所使用的化学交联剂为1-乙基-3-[3_二甲基氨基 丙基]-碳化二亚胺（EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)。
[0018] 作为一个优选方案，步骤（2)中所述交联复合体的浓度为lmg/mL，pH为5. 0,磁力 搅拌器转速为500rpm，三聚磷酸钠浓度为lmg/mL。
[0019] 作为一个优选方案，步骤（2)中交联复合体与三聚磷酸钠的质量比为5:1。
[0020] 为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述制备方法制备获 得的载酶壳聚糖纳米颗粒。
[0021] 为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述制备方法制备获 得的载酶壳聚糖纳米颗粒在制备酶-前药疗法药物中的应用。
[0022] 作为一个优选方案，所述纳米颗粒为一包裹有辣根过氧化物酶的壳聚糖纳米颗 粒，所述前药是指 11引噪_3_乙酸。
[0023] 为实现本发明第四个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述制备方法制备获 得的载酶壳聚糖纳米颗粒与前药吲哚-3-乙酸在制备治疗乳腺癌联合用药物中的应用。
[0024] 本发明的优点在于：（1)本发明制备获得的载酶壳聚糖纳米颗粒用于酶-前药疗 法的稳定性好、生物相容性好、载药量大以及酶包裹效率高；(2)制备方法工艺简单、反应 条件温和、方便快捷、成分无毒害、药物包载率高以及对蛋白分子破坏小；（3)基于壳聚糖 良好的理化和生物性质，从而利用壳聚糖纳米颗粒将催化前药吲哚-3-乙酸（IAA)反应的 辣根过氧化物酶（HRP)通过化学交联的方法固定在壳聚糖分子上，然后进一步利用离子凝 胶法制备壳聚糖纳米颗粒（CS-NPs)将HRP包裹在其中，从而避免了 HRP在体内的降解，并 达到在一定程度的可控释放。
[0025] 本发明的原理及方法：本发明以具有良好理化和生物学性质的壳聚糖分子（CS) 为基体，选用具有良好偶联效率的化学交联剂EDC/NHS，通过EDC活化辣根过氧化物酶 (HRP)表面所带羧基基团-COOH，在NHS的作用下与壳聚糖表面大量伯氨基_順 3反应形成 稳定的酰胺共价键，从而实现辣根过氧化物酶（HRP)与壳聚糖分子（CS)的交联，组成壳聚 糖分子与辣根过氧化物酶（HRP)的复合体（HRP-CS)。再基于离子间的相互作用利用离子凝 胶法，在三聚磷酸钠（TPP)的作用下进一步凝胶化制备出载有辣根过氧化物酶（HRP)的壳 聚糖纳米颗粒（HRP-CS-NPs)。
[0026] 本发明以辣根过氧化物酶作为优选例子，是基于辣根过氧化物酶（HRP)与吲 哚-3-乙酸（IAA)为典型的酶-前药组合，并且辣根过氧化物酶（HRP)的等电点大于5.0， 在PH为5. 0的壳聚糖溶液中带正电。采用本发明方法的酶需满足等电点大于5的条件，在 此条件下酶在PH5.0附近带正电荷，不利于其与表面带正电的壳聚糖发生静电吸引，所以 采用先进行化学交联再进行颗粒制备的方法，适合本条件的酶有过氧化氢酶、溶菌酶、脂肪 酶等。
[0027] 所述的基本原理如图14所示。
[0028] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0029] (1)壳聚糖分子与辣根过氧化物酶（HRP)偶联复合体（HRP-CS)的制备
[0030] 首先将0· 5mg的辣根过氧化物酶（HRP)溶解于ImL的超纯水中，并添加50mg的化 学交联剂1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳化二亚胺（EDC)于上述混合液中，磁力搅拌 30min来活化辣根过氧化物酶（HRP)表面所带的羧基。然后，将IOmg的壳聚糖（CS)溶于 ImL 1 %的醋酸溶液中，于60°C磁力搅拌完全溶解后调节pH到5. 0。最后，将10mg/mL的壳 聚糖溶液于上述活化的辣根过氧化物酶（HRP)混合液混合，并添加40mg的N-羟基琥珀酰 亚胺（NHS)，于4°C下磁力