姜黄素在制备防治猪传染性胃肠炎病毒药物中的应用的利记博彩app

本发明属于生物医药技术领域，更具体的，涉及姜黄素(curcumin)在制备防治猪传染性胃肠炎病毒药物中的应用。

背景技术：

猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus,tgev)属冠状病毒科冠状病毒属成员，是导致以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的猪传染性胃肠炎(transmissiblegastroenteritis,tge)的病因。由tgev引起的猪传染性胃肠炎（tge）是危害世界养猪业的重要疾病之一。不同年龄和品种的猪对本病均易感，其中两周龄以内的仔猪致死率可达100%，5周龄以上猪的病死率很低，成年猪几乎没有死亡。该病1946年由doyle和hutchings在美国首次报道，此后世界上许多国家和地区(日本、英国、法国、荷兰、德国、意大利、前苏联等)都相继报道。我国最早是1956年在广东省揭阳、惠来和汕头市发现该病。自此以后，山东、天津、辽宁、甘肃、河北、山西、陕西等各地陆续发现该病。1976年后该病发病率平均每年以万分之六、七的速度逐年上升，到1987年发病率达1.69％。1987～l989年全国疫病普查，tge在全国各地普遍存在，发病数仍居高不下。据21个省、市、自治区的统计，共发病猪2350.61万头，死亡36.14万头，平均发病率为1.61％，死亡率为0.025％。且近年来发病率呈上升趋势，疫区也更为扩大，并与猪轮状病毒病、猪流行性腹泻混合感染，给养猪业造成了严重的经济损失。疫苗接种虽可在一定程度上预防该病，但不能彻底控制疫情的发生。tgev的防控仍是目前我国乃至世界的难题。

众所周知，病毒感染性疾病是严重危害人类健康的常见病和多发病，寻找和开发无污染、低毒副作用的新的、安全有效的，特别是具有我国自主知识产权的抗病毒药物具有十分重要的理论、经济和社会意义。我国地大物博，有丰富的中草药资源，而用中药治疗疾病在我国有上千年的历史，积累了丰富的经验。近年来，国内外有关抗病毒中药的研究日益增多，从中筛选其有效成分已成为当前抗病毒新药研发的一个热点。

姜黄为我国常用传统中药，是姜科姜黄属植物姜黄（curcumalongal）的干燥根茎。姜黄根茎中含有姜黄素、脱甲氧基姜黄素和脱二甲氧基姜黄素三种姜黄色素。其中姜黄素是一种低分子量的酸类物质，是姜黄制品中最具活性的成分。长期以来，姜黄素一直被用作药物、食品调味剂和着色剂。现代药理学的研究发现，姜黄素具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗诱变和抗病毒等多方面的药理作用。姜黄素因其随处可见，价格低廉而又安全无毒成为了一种极具前景的新型药物（前体）。

近年来，姜黄素的抗病毒作用研究受到国际上的广泛关注，已有的研究表明，姜黄素对多种病毒，包括乙型肝炎病毒（hbv）、丙型肝炎病毒（hcv）、日本脑炎病毒（jev）、艾滋病病毒（hiv）、病毒性出血性败血症病毒（vhsv）、呼吸道合胞病毒（rsv）、流感病毒(iav)及人单纯疱疹病毒i型（hsv-1）等都具有明显的抑制效果。姜黄素是否也具有抗tgev的活性，至今还未有相关的研究或报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有猪传染性胃肠炎防治技术和药物的不足，提供一种能够防治猪传染性胃肠炎的物质——姜黄素(curcumin)。所述姜黄素对tgev有很好的抗病毒作用，且其已广泛用于食品添加剂中，生物安全性好，有望在猪传染性胃肠炎的防治中取得很好的应用前景。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

第一方面，提供姜黄素(curcumin)在制备防治猪传染性胃肠炎药物中的应用。

第二方面，提供姜黄素在制备防治猪传染性胃肠炎病毒药物中的应用。

优选的，所述姜黄素(curcumin)的使用剂量范围为10-50μg/ml。

更优选的，所述姜黄素(curcumin)的使用剂量范围为10-30μg/ml。

第三方面，提供一种抗tgev药物，其包括有效量的姜黄素。

优选的，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。

优选的，所述口服制剂为颗粒剂、散片剂或胶囊剂。

优选的，所述注射制剂为冻干粉针剂。

在本发明的具体实施例中，首先确定了姜黄素对pk-15细胞的安全浓度范围，并以此为依据在pk-15(猪肾上皮细胞)细胞中通过tcid50实验和real-timert-pcr等多种方法证实了姜黄素在不同作用方式下（先加药后接毒、先接毒后加药和药物与病毒混合感作）对tgev都有很好的抗病毒效果，并阐明了姜黄素在tgev吸附过程中的作用；进一步的，运用双荧光素酶报告系统分析姜黄素对tgev感染细胞的细胞因子表达的影响，初步阐明其是通过抑制nf-κb通路来抗tgev增殖。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次证明了姜黄素(curcumin)的抗tgev的作用，姜黄素能够显著降低病毒滴度和n基因的表达，且随着姜黄素浓度的升高，抑制效果越明显；姜黄素还能抑制病毒的吸附过程。姜黄素在先加药后接毒方式下对病毒的抑制效果最好，提示姜黄素对tgev具有一定的预防作用。由于姜黄素在食品添加剂中已有广泛应用，对细胞及机体几乎无毒性，故在猪传染性胃肠炎的防治工作中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为mtt实验检测姜黄素对pk-15的毒性试验结果统计图。

图2为姜黄素抗病毒试验中，先加药后接毒作用方式下的病毒滴度图。

图3为姜黄素抗病毒试验中，先接毒后加药作用方式下的病毒滴度。

图4为姜黄素抗病毒试验中，混合作用方式下的病毒滴度图。

图5为姜黄素抗病毒试验中，三种作用方式处理细胞后经real-timert-pcr试验检测的n基因mrna表达水平。

图6为mtt法检测姜黄素对病毒吸附过程的影响。

图7为real-timert-pcr试验检测姜黄素对ifn-αmrna表达水平的影响。

图8为real-timert-pcr试验检测姜黄素对ifn-βmrna表达水平的影响。

图9为双荧光素酶报告系统检测姜黄素对nf-κb活化信号的影响。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实例所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次重复，结果采用平均值和标准差表示，使用单因素方差分析和t检验分析。所有统计分析均采用以p<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准。

实施例1姜黄素细胞毒性试验

配制姜黄素母液：称取0.1g姜黄素粉末，在超净台上加1mldmso溶解，使储存浓度为100mg/ml，使用时分别用细胞维持液进行稀释成所需要的浓度。

用含10%胎牛血清的dmem培养基培养pk-15细胞，细胞用胰酶消化后铺至96孔板（100μl/孔），37°c5.0%co2培养箱中培养至单层，用不同浓度(0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μg/ml)的姜黄素处理pk-15细胞，每个浓度重复3组，同时设置dmso对照组。作用16-18h后，每孔加入20μlmtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），继续培养4h。终止培养后小心吸去孔内的培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解，再使用多功能酶标仪读取各孔吸光值，作图分析数据。

结果如附图1所示，低浓度（10，20，30，40或50μg/ml）姜黄素处理组细胞的od值与dmso对照组无显著差异（p>0.05），高浓度（60，70，80，90或100μg/ml）姜黄素处理组细胞的od值显著低于dmso对照组（p<0.05），表明姜黄素对pk-15细胞的最大无毒浓度为50μg/ml。

实施例2姜黄素抗病毒试验

第一种作用方式：先加药后接毒

先在24孔板内加不同浓度（0，10，20，30，40，50μg/ml）的姜黄素溶液，37℃培养1.5h后用pbs洗涤3次，加入moi=0.1的tgev感染细胞1.5h，洗涤3次后换含有姜黄素的维持液培养24h。每个浓度设置3个重复。

第二种作用方式：先接毒后加药

先在24孔板内加入moi=0.1的tgev感染1.5h，pbs洗涤3次，加不同浓度（0，10，20，30，40，50μg/ml）的姜黄素溶液，37℃培养1.5h后用pbs洗涤3次，换不含姜黄素的维持液培养24h。每个浓度设置3个重复。

第三种作用方式：毒药混合作用

将moi=0.1的tgev和不同浓度（0，10，20，30，40，50μg/ml）的姜黄素溶液混合37℃培养1.5h后加入细胞中，继续培养1.5h后，pbs洗涤3次，换不含姜黄素的维持液培养24h。每个浓度设置3个重复。

以上三种方式处理的样品均制备两份。一份样品（细胞+上清）反复冻融三次后分装冻存于-80℃，用于后续的tcid50试验；另一份细胞样品用pbs洗3遍，每孔加800μltrizol裂解，提取rna，用于rt-pcr。

将上述步骤4中反复冻融的（细胞+上清）样品各取100μl融化后，进行tcid50实验：在离心管中用含2%fbs的dmem维持液将病毒液作连续10倍的稀释，从10^-1-10^-8。将梯度稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一列，共8孔，100μl/每孔。再在每孔加入细胞悬液100μl，使其细胞量达到2~3×10⁵个/ml。同时设正常细胞对照（两列共16孔，100μl维持液+100μl细胞悬液/孔）。置37℃co2培养箱中培养，每日观察并记录细胞病变结果，一般观察4-6天。按reed-muench两氏法计算结果。

结果如附图2（先加药后接毒）、附图3（先接毒后加药）和附图4（毒药混合作用）所示。结果显示，在三种作用方式中，不同浓度的姜黄素处理细胞后，病毒滴度与对照组都有显著下降，且随着姜黄素的浓度增大，滴度下降越明显，呈现剂量依赖性。表明姜黄素对tgev的增殖有抑制作用，且浓度越高，抑制作用越明显。

提取上述步骤4中trizol裂解的细胞样品总rna，并反转录成cdna后作为模板，以jc-tgev-n-f（5’-ttacaaactcgctatcgcatgg-3’）和jc-tgev-n-r（5’-tgtcacatcacctttacctgca-3’）为引物，进行实时荧光定量pcr测定。

结果如附图5所示。结果显示，与对照组相比，tgevn基因的mrna表达水平在不同方式姜黄素处理后均呈现下调的趋势，表明姜黄素能抑制tgev基因组复制。进一步比较上述三种作用方式下姜黄素的抑制作用，每种方式均显示随着姜黄素浓度的逐渐增加，tgev的mrna表达水平被抑制的效果越明显，呈现一定的剂量依赖性。且先加药后接毒方式对病毒的抑制效果最好，初步提示姜黄素对tgev具有一定的预防作用。

实施例3姜黄素抑制病毒吸附试验

将pk-15细胞汇合度至80%的96孔板置于4℃预冷45min-1h后，加含有不同浓度姜黄素（0，10，20，30，40，50μg/ml）的tgev（100tcid50），每个浓度设置6个重复孔，4℃孵育2h。

预冷的pbs洗3次，将未吸附到病毒表面的病毒清洗掉，然后加入新鲜的维持液100μl/孔，置于37℃co2培养箱中继续培养24h，以mtt法分析姜黄素对tgev吸附过程的影响。

结果如附图6所示。细胞经过吸附实验处理24h后，在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值记录并做成柱状图。结果显示姜黄素浓度在0-50μl范围内，随着其浓度的增加，吸光值越来越高，说明姜黄素对tgev吸附pk-15细胞时有抑制作用，姜黄素具有抗病毒效果。

实施例4姜黄素对细胞因子的影响

1、在24孔板中pk-15细胞汇合至80%时，弃去培养液，pbs洗3遍，以moi=0.1的tgev感染细胞1.5h，洗涤3次后换含有姜黄素（0，30μg/ml）的维持液培养24h。每个浓度设置3个重复，同时设阴性对照和不加任何处理的空白对照。收集细胞对细胞因子ifn-α和ifn-β进行qrt-pcr检测。

结果显示，与tgev处理组相比，姜黄素+tgev处理组能够抑制ifn-α（附图7）和ifn-β（附图8）的mrna表达量。

2、在24孔板中pk-15细胞汇合至60%时，运用脂质体转染法共转染nf-κb荧光素酶报告质粒（0.1μg）和内参对照质粒phrl-tk（0.05μg）。24h后弃去培养液，pbs洗3遍，以moi=0.1的tgev感染细胞1.5h，洗涤3次后换含有姜黄素（0，30μg/ml）的维持液继续培养24h（每个浓度设置3个重复，同时设阴性对照和不加任何处理的空白对照）。

收集样品采用双荧光素酶检测试剂盒（promega）和glomax20/20荧光检测仪分析荧光素酶的活性，通过与内参的比较，确定不同处理组中转录因子nf-κb的活性，以分析姜黄素对nf-κb活化过程的影响。

结果显示：与tgev处理组相比，姜黄素+tgev处理组能够抑制nf-κb的活化（附图9）。

以上结果表明，姜黄素通过干扰nf-κb信号通路来发挥抗病毒作用，抑制tgev的复制。

sequencelisting

<110>武汉生物工程学院

<120>姜黄素在制备防治猪传染性胃肠炎病毒药物中的应用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttacaaactcgctatcgcatgg22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgtcacatcacctttacctgca22