一种丝素蛋白纳米粒和载药丝素蛋白纳米粒的利记博彩app

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种丝素蛋白纳米粒和载药丝素蛋白纳米粒。

背景技术：

眼后段新生血管疾病主要包括老年性黄斑病变、早产儿视网膜病变及糖尿病视网膜病变，是目前导致患者视力缺失和致盲的主要原因。临床治疗眼后段新生血管疾病的常用途径包括：全身给药(如口服和静脉注射等)、眼周给药和玻璃体给药等。其中全身给药途径的顺应性高，但是由于血-视网膜屏障和血脑屏障对药物的阻碍，最终只有1％～5％的药物能进入到玻璃体，眼部生物利用度极低，需要反复给药，导致全身副作用大。眼周给药途径的药物大部分被结膜和脉络膜的毛细血管清除，巩膜、bruch膜和视网膜色素上皮层的生理屏障，使得眼周给药途径的药物难以到达视网膜发挥治疗作用。相比于其他给药方式，玻璃体内给药目前被认为是治疗眼后段疾病最有效的方法，它可以突破角膜、巩膜、血-视网膜屏障、脉络膜和结膜血流消除等多重屏障，在玻璃体和视网膜达到较高的药物浓度。特别对于大分子蛋白药物而言，要使药物分子穿透角膜、巩膜、血-视网膜屏障、脉络膜等多重屏障，最终到达视网膜和脉络膜发挥药效，玻璃体注射给药是最好的途径。

频繁的玻璃体注射给药易给患者带来不良反应和创伤，具有缓释效果的药物传递系统通过玻璃体注射，可有效降低给药频率，增加药物在眼内的滞留量，最终达到提高药物生物利用度及患者用药顺应性的目的。

药物通过化学交联或静电吸附等方式包封于载体材料中或连接于载体材料表面形成的粒径在10～1000nm范围内的胶态粒子为纳米粒，水溶性和脂溶性药物均可用于纳米粒传递系统。细胞对粒径小于250nm的纳米粒具有吞噬作用，玻璃体注射后，纳米粒更易聚集在视网膜上，从而有效提高视网膜对药物的摄取量；此外，还可在纳米粒表面连接一些特定的基团，利用特定基团与细胞表面的蛋白或其他受体的特异性结合作用，提高细胞对纳米粒的摄取量。因此，相比于原位凝胶、微球等其它眼部给药制剂，纳米粒在视网膜疾病的治疗中有其独特优势。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种丝素蛋白纳米粒和载药丝素蛋白纳米粒，该丝素蛋白纳米粒能够提高药物的生物利用度。

本发明提供了一种丝素蛋白纳米粒，由以下方法制得：

s1)将丝素蛋白溶于水中，在2～6℃下静置2～8h，得到丝素蛋白溶液；

s2)将体积比为1:4～8的丝素蛋白溶液和有机溶剂混合，搅拌，得到纳米粒混悬液，所述有机溶剂选自乙醇、异丙醇或丙酮；

s3)将所述纳米粒混悬液离心分离，去离子水重分散并洗涤，离心得到纳米粒沉淀；

s4)将所述纳米粒沉淀和水混合，超声，得到丝素蛋白纳米粒。

优选地，所述步骤s1)中丝素蛋白溶液的浓度为10～50mg/ml。

优选地，所述步骤s2)中混合的温度为20～60℃。

优选地，所述步骤s3)中离心的转速为8000～20000rpm；所述离心的温度为4℃；所述离心的时间为25～35min。

优选地，所述步骤s4)中丝素蛋白纳米粒的浓度为18～22mg/ml。

本发明提供了一种载药丝素蛋白纳米粒，由以下方法制得：

将上述技术方案所述丝素蛋白纳米粒和蛋白药物混合，加入交联剂交联反应，加入终止剂终止反应，将反应产物离心，分离得到沉淀产物；

将所述沉淀产物重分散，多次离心洗涤分离后再加水超声重分散，得到载药丝素蛋白纳米粒。

优选地，所述交联剂选自戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺或n-羟基琥珀酰亚胺。

优选地，所述丝素蛋白纳米粒和蛋白药物的质量比为5～30:1。

优选地，所述反应产物离心的温度为2～5℃；反应产物离心的时间为28～33min；反应产物离心的转速为15500～16500rpm。

优选地，所述交联反应的温度为2～5℃；所述交联反应的时间为22～28h。

本发明提供了一种丝素蛋白纳米粒，由以下方法制得：s1)将丝素蛋白溶于水中，在2～6℃下静置2～8h，得到丝素蛋白溶液；s2)将体积比为1:4～8的丝素蛋白溶液和有机溶剂混合，搅拌，得到纳米粒混悬液，所述有机溶剂选自乙醇、异丙醇或丙酮；s3)将所述纳米粒混悬液离心分离，去离子水重分散并洗涤，离心得到纳米粒沉淀；s4)将所述纳米粒沉淀和水混合，超声，得到丝素蛋白纳米粒。本发明提供的丝素蛋白纳米粒能够提高药物在细胞内的摄取量，延长药物的滞留时间，具有胞内高效、长效及靶向的优势，有利于提高药物的生物利用度。另外，该丝素蛋白纳米粒具有良好的生物粘附性，且无免疫原性，不会引起明显的炎症反应和组织纤维化，生物相容性及安全性好。采用反溶剂法制备丝素蛋白纳米粒，并通过交联法得到载药丝素蛋白纳米粒，整个制备过程操作简单，条件温和，重现性好。实验结果表明：丝素蛋白纳米粒的平均粒径在250nm以下；丝素蛋白纳米粒呈明显的负电性；1mg/ml的载药丝素蛋白纳米粒体外可持续缓慢释药约一周；arpe-19细胞对载药丝素蛋白纳米粒1h内的摄取率可达到97％以上。

附图说明

图1为本发明实施例1～3制备的丝素蛋白纳米粒的平均粒径及多分散系数结果图；

图2为本发明实施例1～3制备的载药丝素蛋白纳米粒的扫描电镜图；

图3为本发明实施例1～3制备的载药丝素蛋白纳米粒的药物包封率结果；

图4为本发明实施例1～3制备的载药丝素蛋白纳米粒的体外累积释放率结果；

图5为arpe-19细胞在不同时间对实施例1～3制备的载药丝素蛋白纳米粒及fitc-bsa溶液的细胞摄取率结果。

具体实施方式

本发明提供了一种丝素蛋白纳米粒，由以下方法制得：

s1)将丝素蛋白溶于水中，在2～6℃下静置2～8h，得到丝素蛋白溶液；

s2)将体积比为1:4～8的丝素蛋白溶液和有机溶剂混合，搅拌，得到纳米粒混悬液，所述有机溶剂选自乙醇、异丙醇或丙酮；

s3)将所述纳米粒混悬液离心分离，去离子水重分散并洗涤，离心得到纳米粒沉淀；

s4)将所述纳米粒沉淀和水混合，超声，得到丝素蛋白纳米粒。

本发明将丝素蛋白溶于水中，在2～6℃下静置2～8h，得到丝素蛋白溶液。本发明优选在搅拌的条件下将丝素蛋白溶解于水中。本发明优选采用去离子水进行溶解。在本发明的具体实施例中，丝素蛋白溶解于去离子水中在4℃下静置8h；或4℃下静置4h；或4℃下静置2h。在本发明中，所述丝素蛋白溶液的浓度优选为10～50mg/ml，即丝素蛋白溶液的浓度优选为1.0％～5.0％(w/v)；在本发明的具体实施例中，所述丝素蛋白溶液的浓度为1.0％、2.5％或5％。

本发明将体积比为1:4～8的丝素蛋白溶液和有机溶剂混合，搅拌，得到纳米粒混悬液，所述有机溶剂选自乙醇、异丙醇或丙酮。本发明优选将丝素蛋白溶液采用注射器抽取然后快速和有机溶剂混合；在本发明的实施例中，优选将丝素蛋白溶液快速注入有机溶剂中。本发明优选将有机溶剂加热至混合所需的温度，得到恒温有机溶剂；所述混合的温度优选为20～60℃。本发明优选采用本领域技术人员熟知的磁力搅拌器进行搅拌；优选搅拌至形成乳白色的纳米粒混悬液。

得到纳米粒混悬液后，本发明将所述纳米粒混悬液离心分离，加去离子水重分散洗涤，离心得到纳米粒沉淀。在本发明中，所述纳米粒混悬液离心的转速优选为8000～20000rpm；所述离心的优选温度为4℃；所述离心的时间优选为25～35min，更优选为28～32min，最优选为30min。本发明优选将纳米粒混悬液离心，弃去上清液，沉淀用去离子水重分散并洗涤，再次离心分离纳米粒沉淀，重复该操作3次。

得到纳米粒沉淀后，本发明将所述纳米粒沉淀和水混合，超声，得到丝素蛋白纳米粒。在本发明中，所述丝素蛋白纳米粒以丝素蛋白纳米粒混悬液的形式存在；所述丝素蛋白纳米粒混悬液的浓度优选为18～22mg/ml，即丝素蛋白纳米粒混悬液的浓度优选为1.8％～2.2％(w/v)，更优选为1.9％～2.1％，最优选为2.0％。

本发明采用反溶剂法制备的丝素蛋白纳米粒，平均粒径＜250nm，且粒径均一。丝素蛋白纳米粒具有良好的生物粘附性，且无免疫原性，不会引起明显的炎症反应和组织纤维化，生物相容性及安全性好。

本发明提供了一种载药丝素蛋白纳米粒，由以下方法制得：

将上述技术方案所述丝素蛋白纳米粒和药物混合，加入交联剂交联反应，加入终止剂终止反应，将反应产物离心，分离得到沉淀产物；

将所述沉淀产物重分散，多次离心洗涤分离后再加水超声重分散，得到载药丝素蛋白纳米粒。

本发明采用交联法制备得到的丝素蛋白载大分子蛋白药物纳米粒可显著提高大分子蛋白药物在细胞内的摄取量，延长药物的滞留时间，具有胞内高效、长效及靶向的优势，有利于提高药物的生物利用度。

本发明将上述技术方案所述丝素蛋白纳米粒和蛋白药物混合，加入交联剂交联反应，加入终止剂终止反应，将反应产物离心，分离得到沉淀产物。

在本发明中，所述蛋白药物具体为牛血清白蛋白(bsa)；为了便于检测，本发明优选将牛血清白蛋白进行荧光素标记；本发明优选采用异硫氰酸荧光素(fitc)标记。在本发明中，所述丝素蛋白纳米粒和蛋白药物的质量比优选为5～30:1，优选为5～15:1；在本发明的具体实施例中，所述丝素蛋白纳米粒和蛋白药物的质量比具体为5:1，15:1或30:1。

在本发明中，所述交联剂优选选自戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)或n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)。所述交联剂使药物连接在丝素蛋白纳米粒上。

在本发明中，所述交联反应采用的终止剂优选为甘氨酸。所述交联反应的温度优选为2～5℃，更优选为4℃；所述交联反应的时间优选为22～28h，更优选为24h。所述反应产物离心的温度优选为2～5℃，更优选为4℃；反应产物离心的时间优选为28～33min，更优选为30min；反应产物离心的转速为15500～16500rpm，更优选为16000rpm。

本发明优选将所述沉淀产物用去离子水重分散，洗涤后离心分离，重复三次，最后加去离子水超声重分散，得到载药丝素蛋白纳米粒。

本发明采用的反溶剂法及交联法制备丝素蛋白载大分子蛋白药物纳米粒的方法操作简单，条件温和，制备工艺重现性好，且该方法不会影响生物大分子蛋白药物的基本结构，具有临床应用的实际价值。

本发明对制备得到的丝素蛋白纳米粒的分散液用去离子水稀释10倍，采用马尔文激光粒度分析仪(malvern，nanozs90)测定纳米粒的平均粒径及多分散系数(pdi)。实施例表明：丝素蛋白纳米粒的pdi为0.22±0.04；或0.15±0.03；或0.31±0.06。

本发明观测制备得到的载药丝素蛋白纳米粒的混悬液的形态：将载药丝素蛋白纳米粒的混悬液滴加到锡纸上，待其晾干后，将锡纸粘附于铜板上，喷金，真空干燥后采用扫描电子显微镜(jeolltd.,jsm-6330f)观察纳米粒的形态。

本发明待fitc-bsa与丝素蛋白纳米粒交联反应结束后，将反应液在4℃、16000rpm转速条件下离心30min，收集上清液，并用定量去离子水洗涤纳米粒，收集洗涤液，重复操作3次，合并上清液及洗涤液，通过多功能酶标仪(biotek，synergyh1)测定上述混合溶液的荧光强度，计算游离的药物量。包封率采用如下公式计算：

实施例结果表明：包封率为67.11±3.56％；或66.92±6.89％；或58.78±4.21％。

本发明将载药丝素蛋白纳米粒用pbs(ph值7.4)稀释，得到载药丝素蛋白纳米粒的浓度为1mg/ml的分散液，分别取1ml该分散液于离心管中，在37℃、转速为100rpm的恒温气浴摇床中进行体外释放研究，并于0.5h，1h，2h，4h，8h，12h，24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h时，每组取出3管，16000rpm离心20min，采用多功能酶标仪测定上清液的荧光强度，计算fitc-bsa的释药量，并计算出累积释药率。

本发明采用流式细胞术对细胞摄取丝素蛋白载fitc-bsa纳米粒的定量测定，方法如下：

以急性视网膜色素上皮-19细胞(arpe-19)为实验对象，采用流式细胞仪(beckmancoulter，epicsxl)定量检测细胞对制备得到的丝素蛋白载fitc-bsa纳米粒的摄取情况，并以等浓度的fitc-bsa培养液为对照，具体实验操作步骤如下：

(1)用含0.4％胎牛血清的dmem/f12培养液分散制备得到的丝素蛋白载fitc-bsa纳米粒，使纳米粒的浓度为500μg/ml，并配置等fitc-bsa浓度的培养液；

(2)将arpe-19细胞以2.5×10⁴个/孔的密度接种于12孔板中，37℃，5％co2条件下培养24h，至细胞完全贴壁生长；

(3)吸去原培养液，分别加入制备得到的载药纳米粒和等浓度的fitc-bsa培养液，37℃，5％co2条件下孵育1～24h；

(4)吸去培养液，细胞用预冷的pbs冲洗3次，终止摄取；

(5)加入胰蛋白酶消化细胞，4℃，1000rpm转速条件下离心5min，弃去上清液，收集细胞；

(6)向细胞中加入500μlpbs溶液重悬细胞，并立即用流式细胞仪测定细胞摄取量，计数1×10⁴个细胞。

实施例结果表明：1h内arpe-19细胞对载药丝素蛋白纳米粒的摄取率达96.64±3.08％；或97.48±2.22％；或88.96±3.25％。

反溶剂法制备的丝素蛋白纳米粒粒径均一，生物相容性好，通过交联剂可成功包载大分子蛋白类药物，体外可持续释药一周。与大分子溶液相比，丝素蛋白纳米粒可明显提高细胞对药物的摄取率，载药丝素蛋白纳米粒为大分子蛋白类药物用于治疗眼后段新生血管疾病提供了新方法。

本发明针对治疗眼部疾病的大分子蛋白类药物半衰期短、膜渗透性差、生物利用度低、疗效不佳及由于用药频繁引发的多种不良反应等问题，利用反溶剂法和交联法构建了长效、高效、靶向的丝素蛋白载大分子蛋白药物纳米粒给药系统，通过玻璃体注射给药治疗眼后段新生血管疾病。借助丝素蛋白的黏附性、长效释药性、可促进组织修复和重建性能以及纳米粒的视网膜靶向性，提高眼后段特别是视网膜对大分子药物的摄取量，并促进视网膜色素上皮细胞组织修复和重建，同时延长药物释放时间，实现高效、长效、靶向治疗眼后段新生血管疾病的目的，降低由于反复用药给患者带来的不良反应和损伤。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种丝素蛋白纳米粒和载药丝素蛋白纳米粒进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.制备丝素蛋白纳米粒

取丝素蛋白材料溶于去离子水中，持续搅拌直至丝素蛋白完全溶解，配置成浓度为1.0％(w/v)的丝素蛋白溶液，于4℃下静置2h。用注射器抽取上述丝素蛋白溶液，快速注入至60℃恒温乙醇溶液中，乙醇与丝素蛋白水溶液体积比(v/v)为4:1，同时，采用磁力搅拌器持续搅拌混合液，直至形成乳白色纳米粒混悬液，继续恒温搅拌30min。待纳米粒完全形成，将上述纳米混悬液转移至离心管中，4℃，16000rpm条件下离心30min，弃去上清液，沉淀用去离子水重分散并洗涤，再次离心分离纳米粒，重复该操作3次。最后，加入定量去离子水于上述洗涤后的纳米粒中，超声使纳米粒均匀分散成浓度为2.0％(w/v)的混悬液，低温条件下储存备用。

本发明采用上述技术方案所述测试方法对丝素蛋白纳米粒进行平均粒径和多分散系数的测定，结果见图1，图1为本发明实施例1～3的丝素蛋白纳米粒的平均粒径和多分散系数结果图。从图1可以看出：实施例1制备的丝素蛋白纳米粒的平均粒径为168.8±7.4nm，pdi为0.22±0.04；zeta电位值为-25.57±0.99mv，表明丝素蛋白纳米粒呈明显的负电性。

2.制备丝素蛋白载异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(fitc-bsa)纳米粒

量取1ml步骤1中制备得到的浓度为2.0％(w/v)的丝素蛋白纳米粒分散液于烧杯中，加入4mgfitc-bsa，即丝素蛋白纳米粒与药物的质量比为5:1，混合均匀后向混合液中滴入100μl浓度为25％(w/v)的交联剂戊二醛，4℃下避光持续搅拌反应24h。加入500μl甘氨酸溶液(200mg/ml)终止上述反应，将反应液在4℃、16000rpm转速条件下离心30min，分离上清液，沉淀用去离子水重分散后再离心洗涤游离的fitc-bsa，重复该操作3次，最后，加入去离子水于上述洗涤后的载药纳米粒中，超声使纳米粒均匀分散，即得到载fitc-bsa的丝素蛋白纳米粒混悬液。

本发明采用上述技术方案所述测试方法对载药丝素蛋白纳米粒进行形态的观测，结果见图2，图2为本发明实施例1～3的载药丝素蛋白纳米粒的扫描电镜图。由图2可以看出：实施例1制备的载药丝素蛋白纳米粒呈光滑的圆球形，只存在少量纳米粒黏连的现象。

本发明根据上述技术方案所述包封率的测试方法进行包封率的测定及计算；结果见图3，图3为本发明实施例1～3制备的载药丝素蛋白纳米粒的药物包封率结果；图3表明：实施例1采用丝素蛋白纳米粒与药物的质量比为5:1时，包封率为58.78±4.21％；丝素蛋白纳米粒的量可能不足以完全负载药物，导致游离药物多，相比于实施例2，包封率有所降低。

本发明采用上述技术方案所述体外释药效果的测定方法对实施例1制备的载药丝素蛋白纳米粒的累积释药率进行测定，结果见图4，图4为本发明实施例1～3制备的载药丝素蛋白纳米粒的体外累积释药率曲线图；根据图4可以看出：实施例1制备的载药丝素蛋白纳米粒可持续缓慢释药约一周；随着丝素蛋白纳米粒与fitc-bsa质量比值的增加，药物释放速率逐渐减小。

本发明按照上述技术方案所述流式细胞术对细胞摄取丝素蛋白载fitc-bsa纳米粒的定量测定方法对实施例1制备的载药丝素蛋白纳米粒进行摄取率的测试，结果见图5，图5为arpe-19细胞在不同时间对实施例1～3制备的载药丝素蛋白纳米粒及fitc-bsa溶液的细胞摄取率结果；图5表明：实施例1制备的载药丝素蛋白纳米粒孵育1h后，arpe-19细胞对其摄取率达88.96±3.25％。

实施例2

1.制备丝素蛋白纳米粒

取丝素蛋白材料溶于去离子水中，持续搅拌直至丝素蛋白完全溶解，配置成浓度为2.5％(w/v)的丝素蛋白溶液，于4℃下静置4h。用注射器抽取上述丝素蛋白溶液，快速注入至40℃恒温丙酮溶液中，丙酮与丝素蛋白水溶液体积比(v/v)为6:1，同时，采用磁力搅拌器持续搅拌混合液，直至形成乳白色纳米粒混悬液，继续恒温搅拌30min。待纳米粒完全形成，将上述纳米混悬液转移至离心管中，4℃，20000rpm条件下离心30min，弃去上清液，沉淀用去离子水重分散并洗涤，再次离心分离纳米粒，重复该操作3次。最后，加入定量去离子水于上述洗涤后的纳米粒中，超声使纳米粒均匀分散成浓度为2.0％(w/v)的丝素蛋白纳米粒混悬液，低温条件下储存备用。

本发明采用上述技术方案所述测试方法对丝素蛋白纳米粒进行平均粒径和多分散系数的测定，结果见图1。从图1可以看出：实施例2制备的丝素蛋白纳米粒的平均粒径为207.9±5.6nm，pdi为0.15±0.03；zeta电位值为-27.50±0.87mv，表明丝素蛋白纳米粒呈明显的负电性。

2.制备丝素蛋白载fitc-bsa纳米粒

量取3ml步骤1中制备得到的浓度为2.0％(w/v)的丝素蛋白纳米粒分散液于烧杯中，加入4mgfitc-bsa，即丝素蛋白纳米粒与药物的质量比为15:1，混合均匀后向混合液中滴入100μl浓度为15％(w/v)的交联剂edc，4℃下避光持续搅拌反应24h。加入500μl甘氨酸溶液(200mg/ml)终止上述反应，将反应液在4℃、16000rpm转速条件下离心30min，分离上清液，沉淀用去离子水重分散后再离心洗涤游离的fitc-bsa，重复该操作3次，最后，加入去离子水于上述洗涤后的载药纳米粒中，超声使纳米粒均匀分散，即得到载fitc-bsa的丝素蛋白纳米粒混悬液。

本发明采用上述技术方案所述测定方法对载药丝素蛋白纳米粒进行形态的观测，结果见图2。由图2可以看出：实施例2制备的载药丝素蛋白纳米粒呈光滑的圆球形，无纳米粒黏连，且粒径均匀。

本发明根据上述技术方案所述包封率的测定方法进行包封率的测定及计算；结果见图3。图3表明：实施例2采用丝素蛋白纳米粒与药物的质量比为15:1时，包封率为66.92±6.89％。

本发明采用上述技术方案所述体外释药效果的测定方法对实施例2制备的载药丝素蛋白纳米粒的累积释药率进行测定，结果见图4；由图4可以看出：实施例2制备的载药丝素蛋白纳米粒可持续缓慢释药约一周。

本发明按照上述技术方案所述流式细胞术对细胞摄取丝素蛋白载fitc-bsa纳米粒的定量测定方法对实施例2制备的载药丝素蛋白纳米粒进行摄取率的测定，结果见图5，结果表明：实施例2制备的载药丝素蛋白纳米粒孵育1h后，arpe-19细胞对其摄取率已达97.48±2.22％；而此时fitc-bsa溶液组的摄取率只有5.35±2.06％。随着孵育时间的增加，溶液组的摄取率逐渐升高，而载药丝素蛋白纳米粒组的摄取率基本保持平稳，孵育24h后，载药丝素蛋白纳米粒的细胞摄取率仍远远高于溶液组，表明将大分子蛋白药物载于丝素蛋白纳米粒上可以显著提高细胞对药物的摄取率，从而可有效提高药物的生物利用度。

实施例3

1.制备丝素蛋白纳米粒

取丝素蛋白材料溶于去离子水中，持续搅拌直至丝素蛋白完全溶解，配置成浓度为5.0％(w/v)的丝素蛋白溶液，于4℃下静置8h。用注射器抽取上述丝素蛋白溶液，快速注入至20℃恒温异丙醇溶液中，异丙醇与丝素蛋白水溶液体积比(v/v)为8:1，同时，采用磁力搅拌器持续搅拌混合液，直至形成乳白色纳米粒混悬液，继续恒温搅拌30min。待纳米粒完全形成，将上述纳米混悬液转移至离心管中，4℃，8000rpm条件下离心30min，弃去上清液，沉淀用去离子水重分散并洗涤，再次离心分离纳米粒，重复该操作3次。最后，加入定量去离子水于上述洗涤后的纳米粒中，超声使纳米粒均匀分散成浓度为2.0％(w/v)的混悬液，低温条件下储存备用。

本发明采用上述技术方案所述测定方法对丝素蛋白纳米粒进行平均粒径和多分散系数的测定，结果见图1。从图1可以看出：实施例3制备的丝素蛋白纳米粒的平均粒径为239.4±8.5nm，pdi为0.31±0.06；zeta电位值为-24.17±0.45mv，表明丝素蛋白纳米粒呈明显的负电性。

2.制备丝素蛋白载fitc-bsa纳米粒

量取6ml步骤1中制备得到的浓度为2.0％(w/v)的丝素蛋白纳米粒分散液于烧杯中，加入4mgfitc-bsa，即丝素蛋白纳米粒与药物的质量比为30:1，混合均匀后向混合液中滴入100μl浓度为15％(w/v)的交联剂nhs，4℃下避光持续搅拌反应24h。加入500μl甘氨酸溶液(200mg/ml)终止上述反应，将反应液在4℃、16000rpm转速条件下离心30min，分离上清液，沉淀用去离子水重分散后再离心洗涤游离的fitc-bsa，重复该操作3次，最后，加入去离子水于上述洗涤后的载药纳米粒中，超声使纳米粒均匀分散，即得到载fitc-bsa的丝素蛋白纳米粒混悬液。

本发明采用上述技术方案所述测试方法对载药丝素蛋白纳米粒进行形态的观测，结果见图2。由图2可以看出：实施例3制备的载药丝素蛋白纳米粒呈光滑的圆球形，只存在部分粒径较大的纳米粒。

本发明根据上述技术方案所述包封率的测试方法进行包封率的测定及计算；结果见图3。图3表明：实施例3采用丝素蛋白纳米粒与药物的质量比为30:1时，包封率为67.11±3.56％；其包封率并未比二者比例为15:1时有明显的改善，造成这一现象的原因可能是丝素蛋白纳米粒的载药能力存在上限。

本发明采用上述技术方案所述体外释药效果的测定方法对实施例3制备的载药丝素蛋白纳米粒的累积释药率进行测定，结果见图4；由图4可以看出：实施例3制备的载药丝素蛋白纳米粒可持续缓慢释药约一周。

本发明按照上述技术方案所述流式细胞术对细胞摄取丝素蛋白载fitc-bsa纳米粒的定量测定方法对实施例3制备的载药丝素蛋白纳米粒进行摄取率的测定，结果见图5，图5表明：实施例3制备的载药丝素蛋白纳米粒孵育1h后，arpe-19细胞对其摄取率达96.64±3.08％。

由以上实施例可知，本发明提供了一种丝素蛋白纳米粒，由以下方法制得：s1)将丝素蛋白溶于水中，在2～6℃下静置2～8h，得到丝素蛋白溶液；s2)将体积比为1:4～8的丝素蛋白溶液和有机溶剂混合，搅拌，得到纳米粒混悬液，所述有机溶剂选自乙醇、异丙醇或丙酮；s3)将所述纳米粒混悬液离心分离，去离子水重分散洗涤，离心得到纳米粒沉淀；s4)将所述纳米粒沉淀和水混合，超声，得到丝素蛋白纳米粒。载药后的丝素蛋白纳米粒可提高药物在细胞内的摄取量，延长药物的滞留时间，具有胞内高效、长效及靶向的优势，有利于提高药物的生物利用度。另外，该丝素蛋白纳米粒具有良好的生物粘附性，且无免疫原性，不会引起明显的炎症反应和组织纤维化，生物相容性及安全性好。采用反溶剂法制备丝素蛋白纳米粒，并通过交联法得到载药丝素蛋白纳米粒，整个制备过程操作简单，条件温和，重现性好。实验结果表明：丝素蛋白纳米粒的平均粒径均在250nm以下；丝素蛋白纳米粒呈明显的负电性；1mg/ml的载药丝素蛋白纳米粒分散液体外可持续缓慢释药约一周；arpe-19细胞对载药丝素蛋白纳米粒的1h内的摄取率可达到97％以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。