一种载有石杉碱甲明胶纳米粒微球的制备方法和用途与流程

本发明属医药技术领域，涉及一种载有明胶纳米粒的新型微球制剂的制备方法。

背景技术：

阿尔茨海默病（alzheimer′sdisease，ad），俗称老年痴呆，是一种进行性记忆缺失和痴呆为特征的慢性神经系统退行性疾病。即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白沉积，神经原纤维缠结，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑的形成，在发达国家已被列为第四位最常见的死亡原因。其临床上主要表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆。

乙酰胆碱酯酶抑制剂（achei）是最先被批准用于治疗ad的药物，石杉碱甲（huperzinea）是从中药石杉属植物千层塔中提取出来的天然植物碱，是一种强效、可逆和高选择性第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂,其能很好地透入血脑屏障，进入中枢后较多地分布于与学习和记忆有密切联系的脑区，其较低剂量对乙酰胆碱酯酶(ache)有强大的抑制作用，使分布区内神经突触间隙的乙酰胆碱(ach)含量明显升高，从而增强神经元兴奋传导，强化学习与记忆脑区的兴奋作用，起到提高认知功能、增强记忆保持和促进记忆再现的作用。是目前国内开发最为成功的治疗阿尔茨海默病的药物。

目前，临床使用的石杉碱甲剂型有普通的片剂、胶囊及注射剂，这类普通剂型，需要频繁给药，给本身就患有老年痴呆的患者带来极大不便，经常用药不及时，极易造成不良后果；处于研发及临床研究的有石杉碱甲缓释片、缓释贴片、长效缓释微球、鼻用原位凝胶等。虽然该类制剂在处方上延长药物的释放，达到缓释目的，减少患者用药次数，且缓释贴片避开药物首过效应，释放平缓，但其释放时间均较短，仅几天时间；同时，其它缓释制剂均在不同程度上表现出药物突释现象，而石杉碱甲又是高效可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂，其剂量过大时可引起头晕、恶心、胃肠道不适、胸闷、乏力、心动过缓等反应。因此，在其释放时控制药物释放的量及其重要，这样可以更好地避免副作用的发生。

注射用缓释制剂如纳米粒、微球由于具有良好生物相容性及缓释效果，被认为具有广阔的前景。石杉碱甲微球在很多专利及文献中已被报道过，但其都有一个难以解决的问题就是药物的突释现象，而纳米粒易聚集不稳定的特点也十分突出。

技术实现要素：

本发明针对现有技术不足，提供一种可解决突释现象，同时尽可能减少患者副作用的缓释制剂。

具体来说，本发明提供了如下技术方案：

一种载有石杉碱甲明胶纳米粒微球的制备方法，步骤如下：

步骤（1）明胶纳米粒的制备

用0.1mol/l盐酸溶液配制ph=5的去离子水,加入石杉碱甲与表面活性剂并全部溶解于制备的去离子水中；

向上述溶液中加入明胶并于水浴40～55℃条件下搅拌使所述明胶充分溶胀；在200～800rpm搅拌的条件下加入凝聚剂，之后逐滴加入交联剂，搅拌固化，然后减压旋蒸除去未反应的凝聚剂与交联剂，之后超滤、浓缩，即得明胶纳米粒混悬液；

所述表面活性剂为聚乙烯醇、二-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠、聚乙二醇、吐温、司盘、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆和乙基纤维素中的任意一种或多种混合，所述凝聚剂为异丙醇、无水乙醇中的任意一种或两种混合，所述交联剂可为甲醛、乙二醛、戊二醛中的任意一种或多种混合；

其中，加入的石杉碱甲、表面活性剂、明胶、凝聚剂和交联剂的质量比为(5～100):(50～1000):(50～1000):(200～4000):(300～6000)；

步骤（2）石杉碱甲明胶纳米粒微球的制备

采用w/o/w液中干燥复乳法的制备步骤:将步骤（1）制备的明胶纳米粒混悬液在3000～14000rpm高速剪切时滴加到质量浓度为5%-40%的高分子聚合物材料的油相中，形成w/o型初乳，滴加的所述明胶纳米粒混悬液与高分子聚合物材料的油相体积比为1:(3～10)；将制备的w/o型初乳3000-10000rpm分散到溶液a中，形成w/o/w型复乳，所得复乳100～800rmp搅拌1～5h，得到固化微球；

将得到的固化微球进行离心、洗涤、冷冻干燥，即得到石杉碱甲明胶纳米粒微球；

其中，所述高分子聚合物材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）或其衍生物、聚缩酮（pcadk）或其衍生物中的任意一种或多种混合；

所述溶液a是质量浓度为0.5～10%的聚乙烯醇的水溶液，所述w/o型初乳与溶液a体积比1：（50～500）；

所述的溶解高分子聚合物材料溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、乙醚中的任意一种或多种混合。

为实现上述发明目的，优选所述高分子聚合物材料在油相中的质量浓度为10%-20%。

为实现上述发明目的，优选所述凝聚剂为异丙醇，所述交联剂为戊二醛。

为实现上述发明目的，上述制备方法中步骤（2）采用o/w液中干燥法制备固化微球，步骤如下:

将步骤（1）制备的明胶纳米粒混悬液冻干，得到明胶纳米粒干粉颗粒，搅拌条件下将其分散到质量浓度为5%～40%的高分子聚合物材料的油相中，所述明胶纳米粒干粉颗粒与高分子聚合物材料的油相体积比为1:(1～50)，然后将制备的油相3000～14000rpm分散到溶液a中，形成o/w乳剂，所得乳剂100～800rmp搅拌1～5h，得到固化微球。

为实现上述发明目的，上述制备方法中步骤（2）采用喷雾干燥法制备石杉碱甲明胶纳米粒微球，步骤如下:

在搅拌下将步骤（1）制备的纳米粒混悬液或明胶纳米粒干粉颗粒分散到质量浓度为5%-40%的高分子聚合物材料的油相中制备出颗粒均匀的混悬液，所述明胶纳米粒干粉颗粒与高分子聚合物材料的油相体积比为1:(1～50)，然后将所述混悬液雾化喷入干燥室，使所述混悬液滴瞬间失去有机溶剂，使所述混悬液滴中的颗粒包裹于高分子聚合物材料之中，得石杉碱甲明胶纳米粒微球。

本发明中微球材料不但可选择聚乳酸-羟基乙酸共聚物或其衍生物，还可选择聚缩酮及其衍生物，这两种材料都是高分子材料，前者被美国fda批准用于制剂辅料，后者聚缩酮是由1,4-环己烷二甲醇与2,2-二甲氧基丙烷直接聚合而成的生物可降解材料，降解产物为丙酮和二醇，相对于其它降解产物为酸性物质的高分子材料，利用其制备成微球注射给药，不会对注射部位产生炎症反应，极大减少患者痛苦。

上述制备方法制备的石杉碱甲明胶纳米粒微球应用于石杉碱甲所适用的各种疾病症状的治疗，优选用于注射、鼻腔给药。

有益效果：

本发明的方法针对石杉碱甲对药物释放量的要求，结合纳米粒与微球的释药特点，将纳米粒与微球制剂结合起来，解决石杉碱甲缓释制剂突释问题，同时还可达到持续缓慢释放的目的。

附图说明

图1为本发明实施例1中载有石杉碱甲明胶纳米粒透射电镜照片；

图2为本发明实施例1中载有石杉碱甲明胶纳米粒微球扫描电镜照片；

图3为本发明实施例1中载有石杉碱甲明胶纳米粒微球的体外释放曲线；

图4为本发明对比例1中载有石杉碱甲微球体外释放曲线。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

实施例1

w/o/w型石杉碱甲明胶纳米粒微球的制备

（1）取60mg石杉碱甲与100mg吐温-80加入10mlph=5去离子水中溶解，在水浴50℃条件下加入200mg明胶使充分溶胀。300r/min搅拌的条件下加入无水乙醇800mg，之后加入戊二醛1000mg，搅拌固化，减压旋蒸除去多余的有机溶剂，包括无水乙醇和戊二醛，然后超滤除去游离药物、浓缩，得明胶纳米粒混悬液。

（2）取0.2ml明胶纳米粒浓缩液(等于石杉碱甲20mg)在12000rpm高速剪切时滴加到质量浓度为15%的plga的二氯甲烷中，形成w/o型初乳，初乳10000rpm分散到浓度为1%的聚乙烯醇（pva）水溶液中，形成w/o/w型复乳，所得复乳800rmp搅拌3h，得到固化微球，将得到的固化微球进行离心、洗涤、冷冻干燥，得到石杉碱甲明胶纳米粒微球。

载有石杉碱甲明胶纳米粒透射电镜照片见图1，载有石杉碱甲明胶纳米粒微球扫描电镜见图2，结果表明，明胶纳米粒形态圆整，石杉碱甲明胶纳米粒微球粒径小于100um；体外释放曲线见图3，具有明显缓释效果，且突释较小。

实施例2

w/o/w型石杉碱甲明胶纳米粒微球的制备

（1）取20mg石杉碱甲与50mg吐温-20加入10mlph=5去离子水中溶解，在水浴50℃条件下加入200mg明胶使充分溶胀。300r/min搅拌的条件下加入异丙醇700mg，之后加入甲醛800mg，搅拌固化，减压旋蒸除去多余的有机溶剂，包括异丙醇、甲醛，然后超滤除去游离药物、浓缩，得明胶纳米粒混悬液。

（2）取0.2ml明胶纳米粒浓缩液(等于石杉碱甲10mg)在12000rpm高速剪切时滴加到质量浓度20%的plga的二氯甲烷中，形成w/o型初乳，初乳10000rpm分散到浓度为2%的pva水溶液中，形成w/o/w型复乳，所得复乳800rmp搅拌3h，得到固化微球，将得到的固化微球进行离心、洗涤、冷冻干燥，得到石杉碱甲明胶纳米粒微球。

实施例3

o/w型石杉碱甲明胶纳米粒微球的制备

（1）取10mg石杉碱甲与60mg吐温-20加入10mlph=5去离子水中溶解，在水浴50℃条件下加入100mg明胶使充分溶胀。300r/min搅拌的条件下加入异丙醇1400mg，之后加入甲醛1800mg，搅拌固化，减压旋蒸除去有机溶剂，包括异丙醇、甲醛，然后超滤除去游离药物、浓缩，得明胶纳米粒混悬液。

（2）将明胶纳米粒混悬液冻干，得明胶纳米粒干粉(等于石杉碱甲5mg)。将其分散到质量浓度为15%的plga的二氯甲烷，将油相12000rpm分散到质量浓度2%的pva水溶液中，形成o/w乳剂，所得乳剂800rmp搅拌2h，得到固化微球，将得到的固化微球进行离心、洗涤、冷冻干燥，得到石杉碱甲明胶纳米粒微球。

实施例4

喷雾干燥法制备石杉碱甲明胶纳米粒微球

（1）取5mg石杉碱甲与50mg吐温-20加入10mlph=5去离子水中溶解，在水浴50℃条件下加入50mg明胶使充分溶胀。300r/min搅拌的条件下加入异丙醇200mg，之后加入甲醛300mg，搅拌固化，减压旋蒸除去有机溶剂，包括异丙醇、甲醛，然后超滤除去游离药物、浓缩，得明胶纳米粒混悬液。

（2）将明胶纳米粒混悬液冻干，得明胶纳米粒干粉(等于石杉碱甲3mg)。将其在10000rpm条件下分散到质量浓度为15%的plga的二氯甲烷中，形成颗粒分散均匀的混悬液；通过喷雾干燥方法，即在进入仪器干燥室后，混悬液滴瞬间失去有机溶剂，使混悬液滴中的颗粒包裹于高分子材料之中，形成石杉碱甲明胶纳米粒微球。

实施例5

喷雾干燥法制备石杉碱甲明胶纳米粒微球

（1）取5mg石杉碱甲与50mg吐温-20加入10mlph=5去离子水中溶解，在水浴50℃条件下加入50mg明胶使充分溶胀。300r/min搅拌的条件下加入异丙醇200mg，之后加入甲醛300mg，搅拌固化，减压旋蒸除去有机溶剂，包括异丙醇、甲醛，然后超滤除去游离药物、浓缩，得明胶纳米粒混悬液。

（2）取将纳米粒混悬液0.2ml(等于石杉碱甲2mg)，在在10000rpm条件下将其分散到质量浓度为15%的plga的二氯甲烷中，形成w/o乳剂；通过喷雾干燥方法，即在进入仪器干燥室后，乳滴瞬间失去水与有机溶剂，使明胶纳米粒包裹于高分子材料之中，形成石杉碱甲明胶纳米粒微球。

对比例1

载有石杉碱甲微球的制备

取石杉碱甲10mg溶解到质量浓度为15%的plga的二氯甲烷中，10000rpm高速剪切，分散到浓度为1%的pva水溶液中，形成o/w型乳剂，800rmp条件下搅拌3h，然后微球洗涤3次，冷冻干燥即得。

载有石杉碱甲微球体外释放曲线见图4。

作为本发明的实施例1及对比例1，选用的plga材料为la/ga=50:50,代数分别为1a、2a、2h、2.5a、3a、3h、4a、4h；la/ga=75:25,代数分别为1a、2a、2h、2.5a、4a、5a、7e、7a-p；la/ga=85:15，代数分别为4a、5a、6a、7a。

通过实施例1与对比例1的体外释放曲线可知，石杉碱甲明胶纳米粒微球比普通微球较好的解决了药物的突释情况，且缓释时间长于普通微球，释放16天累积释放百分率达70%左右，作用时间更持久，这对于保持石杉碱甲有效治疗浓度，减少不良反应起重要作用。

本发明采用明胶纳米粒包裹于微球中形成纳米粒微球复合制剂，在保证微球释放特性的同时，利用纳米粒的缓释、微粒的特点，使药物尽可能减少扩散释放的几率，使其更大程度上位于微球的骨架内部，达到无突释及缓释的效果。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。