一种RGD噬菌体/丝素复合止血材料及其制备方法与流程

本发明属于生物医学材料领域，涉及了一种可控降解的rgd噬菌体/丝素复合快速止血材料的制备方法。

背景技术：

在临时性事故的急救治疗、手术过程中的创伤止血都需要合适的止血方法进行快速止血，而病患者局部有效地快速止血非常重要，可有效降低人员伤亡。目前报道的快速止血材料种类主要有三类：粉末状(如沸石、胶原粉末等)、纤维膜(如氧化再生纤维素等)、多孔海绵材料(如明胶海绵等)。然而这些原料做成的止血材料的作用机理和使用方法不尽相同，止血药主要通过增强体内凝血因素或抑制抗凝血因素以促使凝血、达到止血目的，止血效果也有差别。沸石粉末能够在创伤部位快速止血，但是在吸收血液中的水分后会放出大量的热，导致伤口二次创伤和炎症反应；明胶和胶原对血细胞的黏附力较差，又因为胶原和明胶都是从动物体内提取的产物，因此用于人体当中存在免疫原性的问题；虽然以上研究成果能够促进止血材料的发展和提升止血材料的性能，但至今尚没有一种很好的能够快速止血的材料。

随着对止血材料止血性能要求的不断提高，开发出止血速度更快、效果更佳的止血材料势在必行。活化的血小板糖蛋白复合物作为受体能识别并结合纤维蛋白原等粘附蛋白所共有的rgd序列(精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸)，导致血小板聚集和血栓形成。

但是在这些相关的研究中，止血因子或者止血剂常为化学小分子或者为力学性能欠缺的多孔材料，不适于大面积创口的止血。还未曾有过将rgd噬菌体与丝素蛋白水溶液进行复合混，然后制备具有优良力学性能、快速止血、高孔隙率的止血材料，用于人体创伤止血的报道。

丝素纤维是一种天然纤维蛋白，含有对人体所需的18种氨基酸，家蚕丝蛋白因其独特的力学性能和良好的生物相容性、降解可控性、抗菌性、稳定性，以及无免疫原性，在生物材料领域有着广泛的应用，如可制备成纤维状、膜状、多孔状、凝胶状、粉末状等多种形式，应用于固定化酶、抗原抗体载体、药物缓释载体及凝血材料等的研究。丝素蛋白在开发快速止血材料方面有着更大的优势。再生丝素材料对细胞的粘附性较强，表皮细胞、成纤维细胞、间充质干细胞和其它成体细胞都可以在丝素膜上良好地生长，发挥其功能。丝素大分子在细胞周围构成高度水合的凝胶或纤维状网络，对血液中的特定细胞群有支持、粘附、保护的作用。同时，丝素蛋白溶液可以通过材料制备方法制备出2维或者3维材料，为止血因子或者止血剂提供一个合适的储藏微环境，充当“骨架”的作用。噬菌体结构跨越了一般化学和材料科学的典型尺度，在水中具有优越的分散性。其外壳蛋白展示有大量的含氧活性基团，如羰基、羧基、羟基与环氧基等。因此，为氧化石墨烯与丝素蛋白之间的相互作用提供了大量的结合位点。因此基于丝素蛋白的止血支架材料在生物材料领域有很好的应用前景。

技术实现要素：

针对传统制备技术中存在的不足，本发明提供了一种由丝蛋白制成的生物可吸收的天然生物材料作为支撑部分，结合rgd噬菌体的可控降解的rgd噬菌体/丝素止血材料，具有显著的促进凝血效应。主要用于皮肤创面、脏器的的止血，是一种理想的止血材料。

一种rgd噬菌体/丝素复合止血材料，以天然高分子材料丝素蛋白材料为载体，以rgd噬菌体为核心止血剂，制成可控降解的止血支架材料。

其中，复合止血材料中丝素终浓度：0.001％～40％,rgd噬菌体终浓度：10²pfu/ml～10²⁰pfu/ml。

优选的，所述rgd噬菌体包含活性成分rgd肽的止血材料,所述rgd肽序列为:精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(arg-gly-asp)；rgd肽是通过噬菌体展示技术得到，方法如下：1)噬菌体展示载体的构建；2)tg1细胞的活化及扩增；3)连接和转化tg1细胞；4)基因测序；5)噬菌体展示及扩增。

另外，本发明提供了一种快速性止血纱布，由rgd噬菌体/丝素复合止血材料制备而成。

丝素蛋白材料本身止血能力有限，目前丝素蛋白止血材料的研究是从材料的结构、电荷以及界面性质等方面进行。丝素蛋白是一种含有赖氨酸、精氨酸等阳离子氨基酸的高分子蛋白质，能够与带负电的血小板和红细胞产生一定的静电吸附作用。而申请号为201510953638.1(一种rgd-m13噬菌体/氧化再生纤维素氧化再生纤维素)的专利，其采用的策略为使用氧化再生纤维素为材料支撑部分，氧化再生纤维素止血原理为酸性羧基会导致溶血，使得血红细胞溶解、破裂，并释放出血红蛋白参与凝血。因此使用丝蛋白作为凝血材料不破坏血液中细胞的活性，具有生物相容性高的特性。凝丝素蛋白的活性基团化学特性不同，可以与血小板、红细胞膜表面的抗体分子进行多重反应，同时也存在离子键和氢键等非共价键的结合作用。由于氨基的亲水性，能够促进纤维蛋白原吸附的数量，从而会增加血小板粘附和促进血栓，达到止血效果。丝素材料表面吸附了血液中的蛋白质,激发血小板和凝血因子,从而发生凝血。因此，在应用研究方面,可以用丝素作为一种止血剂的载体,一方面又能够提高和改善凝血因子的保存，增强止血效果。

本发明高浓度丝素与rgd噬菌体共混水溶液具有良好的混合性，如图2所示为高浓度丝素与rgd噬菌体的共混水溶液的原子力显微图：长纤维状物体为噬菌体，白色颗粒为丝素，丝素颗粒能够均匀分布在噬菌体纤维的表面(图2b为图2a的放大图)，制得的复合支架材料的止血效果优良，并且具有可控的降解率，具有广泛的应用前景。

另外本发明还提供了一种可控降解的rgd噬菌体/丝素止血材料的制备方法，工艺简单，处理方便。

本发明的技术方案如下：

一种可控降解的rgd噬菌体/丝素止血材料的制备方法，采用如下步骤：

1)将蚕茧脱胶后得到的纤维状丝素依次经过溶解、过滤、透析和离心后，浓缩至质量百分数为1％～25％的丝素蛋白水溶液；

2)将浓度为10⁷pfu/ml～10¹⁵pfu/ml的噬菌体溶液超声进行分散，与0.001％-40％丝素蛋白溶液混合，搅拌均匀，得到rgd噬菌体/丝素复合溶液；

3)再采用冷冻干燥法得到不同形貌的三维蜂窝状多孔结构的rgd噬菌体/丝素复合止血材料；

4)根据所需rgd噬菌体/丝素复合止血材料的降解速率，在30％-100％的酒精溶液中处理0.1-24h，止血材料的降解速率能够控制在10min至1个月降解。

所述步骤1)中的丝素原料也可采用家蚕丝胶、丝腺蛋白、野蚕丝蛋白、蜘蛛丝蛋白或重组丝蛋白等丝蛋白，但不限于此。

所述步骤1)中的丝素质量百分数为0.001％～40％的水溶液，丝素蛋白水溶液质量百分数为0.10％～25％。

步骤2)中所述的rgd-噬菌体悬液的浓度为：10²pfu/ml～10²⁰pfu/ml，优先使用浓度为：10⁷pfu/ml～10¹⁵pfu/ml。

步骤2)中所述的rgd-噬菌体是在噬菌体外壳蛋白展示有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)的序列。

其中，rgd-噬菌体的制备方法，包括如下步骤：

1)噬菌体展示载体的构建，其具体步骤如下：

a.设计前引物和后引物用于制备rgd插入片段肽对应碱基序列：

primer1，引入ncoi酶切位点：5′-atccatggcgcgtggcgacgatcccgcaaaagcg-3′；

primer2，引入hindiii酶切位点：5′-gcaagcttttatcagcttgctttcgag-3′；

b.将primer1和primer1分别配成寡聚核苷酸单链溶液，以m13dna为模板使用phusiondna聚合酶扩增整个编码序列；

c.将表达质粒用限制性内切酶酶切；

d.退火寡聚核苷酸链与质粒双酶切产物在t4dna连接酶作用下连接入载体，得到重组质粒；

2)tg1细胞的活化及质粒重组到tg1细胞；

a.将tg1细胞接种至lb培养基中，37℃，220r/min培养4h活化；以步骤1)中的重组质粒转化表达到宿主菌tg1细胞，37℃继续培养，得到感受态细胞；

b.挑取单菌落用于扩增细胞，质粒提取试剂盒提取质粒测序以验证质粒为阳性，证明rgd基因序列在tg1细胞表达，得到感受态tg1细胞；

3)rgd噬菌体扩增及纯化

将步骤2)中的感受态tg1细胞在37℃培养2个小时后加入辅助噬菌体，再加入iptg作为诱导剂，过夜培养；之后高速离心收集上清去除tg1细胞；peg/nacl沉淀、离心收集沉淀得到rgd噬菌体颗粒，重复该步骤2次，rgd噬菌体在去离子水中溶解分散，得到rgd噬菌体水溶液，通过uv光谱计算噬菌体数量；

4)rgd噬菌体冷冻干燥；

将步骤3)中的rgd噬菌体水溶液在冷冻干燥机中-40℃冷冻干燥12-24小时，得到rgd噬菌体粉末。

其中，所述多肽展示在噬菌体的pⅷ外壳蛋白上，或piii、pvi、pix或pvii蛋白位点上。

所述步骤3)得到的rgd噬菌体水溶液浓度为：10⁵pfu/ml～10¹⁵pfu/ml。

所述步骤3)得到的rgd噬菌体水溶液浓度为：10¹¹pfu/ml～10¹³pfu/ml。

本专利给出了快速止血材料的制备工艺及最佳条件。根据不同的手术类型，可以用于皮肤以及不同器官创面的止血，例如肿瘤切除的手术创面或骨组织外伤性破裂的伤口，在发挥止血功能的同时，起到促进损伤组织再生修复的作用，其止血效果要优于单独使用丝素蛋白材料，凝血试验表明，制备的快速性止血纱布，具有快速止血、生物相容性高的特点。通过进一步临床试验研究，有望给出一种新型的可吸收止血制品。

与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：

(1)处理后的丝素蛋白，能吸引血液里带负电荷的血小板和红细胞，增加血小板粘附和促进血栓；

(2)在一定时间后，rgd噬菌体/丝素多孔状止血材料能够降解，再被机体吸收，使得伤口部位不留结痂。

(3)不单纯依赖于丝素蛋白的止血能力，通过复合rgd噬菌体，加速止血材料的止血速度和效果。

附图说明

图1为rgd肽展示在噬菌体外壳pⅷ蛋白的n-端示意图。

图2为高浓度丝素与rgd噬菌体的共混水溶液的原子力显微图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

本申请所用噬菌体止血剂由申请人制备，具体方法如下：

1)噬菌体展示载体的构建，其具体步骤如下：

a.设计前引物和后引物用于制备rgd插入片段肽对应碱基序列：

primer1：5′-atccatggcgcgtggcgacgatcccgcaaaagcg-3′(引入ncoi酶切位点)

primer2：5′-gcaagcttttatcagcttgctttcgag-3′(引入hindiii酶切位点)；

b.将primer1和primer1分别配成寡聚核苷酸单链溶液，以m13dna为模板扩增整个编码序列(使用phusiondna聚合酶)；

c.将表达质粒用限制性内切酶酶切；

d.退火寡聚核苷酸链与质粒双酶切产物在t4dna连接酶作用下连接入载体，得到重组质粒。

2)tg1细胞的活化及质粒重组到tg1细胞；

a.将tg1细胞接种至lb培养基中，37℃，220r/min培养4h活化。以步骤1)中的重组质粒转化表达到宿主菌tg1细胞，37℃继续培养，得到感受态细胞；

b.挑取单菌落用于扩增细胞，质粒提取试剂盒提取质粒测序以验证质粒为阳性，证明rgd基因序列在tg1细胞表达，得到感受态tg1细胞。

3)rgd噬菌体扩增及纯化

将步骤2)中的感受态tg1细胞在37℃培养2个小时后加入辅助噬菌体，再加入iptg作为诱导剂，过夜培养。之后高速离心收集上清去除tg1细胞。peg/nacl沉淀、离心收集沉淀得到rgd噬菌体颗粒，重复该步骤2次，rgd噬菌体在去离子水中溶解分散，得到rgd噬菌体水溶液，通过uv光谱计算噬菌体数量。

4)rgd噬菌体冷冻干燥；

将步骤3)中的rgd噬菌体水溶液在冷冻干燥机中-40℃冷冻干燥24小时，得到rgd噬菌体粉末(如图1)。

实施例1

可控降解的rgd噬菌体/丝素止血材料的制备方法

1)将蚕茧脱胶后得到的纤维状丝素依次经过溶解、过滤、透析和离心后，浓缩至质量百分数为100mg/ml的丝素蛋白水溶液；

2)将浓度为10⁷pfu/ml的噬菌体溶液超声进行分散，与丝素蛋白溶液混合，搅拌均匀，得到rgd噬菌体/丝素复合溶液；

3)再在温度为-20℃下真空冷冻干燥24h，得到三维多孔的rgd噬菌体/丝素复合止血材料；

4)在30％的酒精处理，能够使得三维多孔的rgd噬菌体/丝素止血材料的降解速率控制在一天内。

实施例2

可控降解的rgd噬菌体/丝素止血材料的制备方法，包括如下步骤：

1)将蚕茧脱胶后得到的纤维状丝素依次经过溶解、过滤、透析和离心后，浓缩至质量百分数为1mg/ml的丝素蛋白水溶液；

2)将浓度为10¹⁴pfu/ml的噬菌体溶液超声进行分散，与丝素蛋白溶液混合，搅拌均匀，得到rgd噬菌体/丝素复合溶液；

3)再在温度为-80℃下真空冷冻干燥48h，得到三维多孔的rgd噬菌体/丝素复合止血材料；

4)在80％的酒精处理，能够使得三维多孔的rgd噬菌体/丝素止血材料降解速率基本不发生降解(1个月后溶失率大于80％)。

实施例3

可控降解的rgd噬菌体/丝素止血材料的制备方法，采用如下步骤：

1)将蚕茧脱胶后得到的纤维状丝素依次经过溶解、过滤、透析和离心后，浓缩至质量百分数为0.1mg/ml的丝素蛋白水溶液；

2)将浓度为10²⁰pfu/ml的噬菌体溶液超声进行分散，与丝素蛋白溶液混合，搅拌均匀，得到rgd噬菌体/丝素复合溶液；

3)再采用冷冻干燥法得到三维多孔的rgd噬菌体/丝素复合止血材料；

4)取新鲜兔血2ml，将制备的rgd噬菌体/丝素复合止血材料放入新鲜兔血中，3分钟后新鲜兔血发生凝固。

由此，本发明工艺简单，rgd噬菌体和丝素蛋白之间接触即发生超分子自组装制成止血材料；该发明制得的止血材料具有良好的快速止血效果，而且能够调控噬菌体/丝素止血材料的降解速度，克服现有技术存在的不成形问题，适合于工业化生产；最终得到的rgd噬菌体/丝素止血材料用途广泛，可用于手术过后止血材料、伤口敷料来使用，有助于创面愈合且无刺激，并且环保无污染，具有突出显著的技术效果。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。