一种含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料的制备方法及应用与流程

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料的制备方法及应用。
背景技术：
：卡拉胶(carrageenan)，又称鹿角菜胶，是一种由海洋红藻中提取而出、具有线性硫酸化半乳糖体聚合而成的阴离子多糖。自20世纪被科学家发现以来，卡拉胶被广泛应用于组织化处理、增稠剂以及作为凝胶形成组分用于食品与药物行业之中。经过多年发展，卡拉胶已然成为世界三大海藻胶之一。根据其结构上的差异，目前商业化的卡拉胶主要是κ型、ι型、λ型三种，其中以λ型卡拉胶硫酸酯化程度最高。早在1972年，美国食品与药品监督管理局(foodanddrugsadministration)把卡拉胶群组分在“一般安全”的类别内，同时，由于卡拉胶可预防油脂分离且可以提供营养的性质，fda也允许其应用于婴儿奶制品等产品之中。在2001年，联合国粮农组织和世界卫生组织添加剂专家委员会取消了针对于卡拉胶每日允许摄入量的限制，更进一步的确认了卡拉胶是一种安全、无毒、无副作用的添加剂。部分卡拉胶具有优异的成胶性能，如κ卡拉胶自身已具有凝胶特性，且在溶液中具有微量的k+离子存在的情况下，凝胶强度将会大大提升，有利于在食品行业中的应用。除此之外，卡拉胶还展示出的其许多潜在药用价值，使其在医药行业之中也逐渐得到了广泛的应用。在逐渐深入的研究中，卡拉胶对许多病毒(如：疱疹病毒、hiv病毒等)有广谱的抑制活性作用。尤其是λ卡拉胶能通过阻断病毒对宿主细胞的吸附过程，从而抑制疱疹病毒(hsv-1,hsv-2)的侵染，其活性与含硫量有关。此外卡拉胶在抗肿瘤、抗病毒、降血脂、抗凝结等方面上都有不错的效果，对免疫系统的调节也具有一定的作用。可由于卡拉胶自身属于天然多糖的特性，其种类繁多。在自然界中不同种的海洋红藻中提取得到的卡拉胶在成分以及硫酸酯化等指标上有所不同，甚至在同种海洋红藻通过不同方法提取得到的卡拉胶性质也会有所差异。在市场上，不同公司所制备及出售的商品级卡拉胶在组分与纯度上有所区别，在不同种的卡拉胶可能会同时存在于某种单一的商品级卡拉胶中。这些特性局部上限制了卡拉胶在需要较高稳定性的生物材料领域的应用与发展。琼脂糖是一种从大型海藻之中提出得到的线性多糖，其具有亲水性、电中性、化学稳定性等性质且来源丰富，成本低廉，自发现以来已广泛应用于食品行业。琼脂糖可溶于90℃的热水形成溶液，当其水溶液下降至35℃左右时，琼脂糖分子从不规则卷曲逐渐变成单链或双链螺旋卷曲构象，螺旋构象以柔性链连接起来形成规则排列的三维网状结构，最终使琼脂糖溶液凝胶化。与其他凝胶材料相比，琼脂糖凝胶在机械性能上具有相当的优势(如：粘弹性、压缩性等)且有更优越的生物相容性、可降解性。鉴于以上优良性质，琼脂糖应用于组织工程领域的研究已开展了相当一段时间，并在神经、软骨、口腔黏膜、角膜等方面取得了一些可喜的研究成果。但由于琼脂糖凝胶特殊的防黏连特性，使其无法单独使用，需与其他材料共同使用制成复合材料以提高所制得材料的细胞黏附性。目前琼脂糖凝胶已在软骨填充修复材料、骨缺损修复材料、受损神经保护材料等领域得到充分的研究及应用。皮肤，是人体最大的器官，占正常人体重的16％左右。作为人体与环境间最为关键的物理屏障，皮肤承担这许多维持人体正常运行的重要生理功能。控制部分物质(水、电解质等)进出人体、阻挡各类辐射、隔绝外界有害物质便是这多种重要生理功能的一部分。可作为人体的第一道防线，在外伤发生时，皮肤则是首当其冲受到损伤。鉴于皮肤损伤的普遍性，用于皮肤修复的敷料的研究也受到人们的重视。皮肤修复分为四个阶段：1)止血、2)炎症、3)增殖、4)重塑。针对于每一个阶段，在对皮肤敷料的性能上也产生了不同的要求。理想的皮肤敷料应具有：1)有助于凝血，防止伤口继续出血恶化；2)保护创面透气同时不受外界有害物质感染；3)使用时敷料减轻疼痛且不粘伤口，避免取出时造成二次创伤；4)易于使用、不需频繁更换。在目前市场现有技术中，已有不少敷料产品：1)胶原/尼龙；2)胶原/琼脂；3)丝蛋白；4)脱细胞真皮基质；5)其他天然或人工合成高分子等等。这些产品大多是基于胶原/硫酸软骨素、胶原/尼龙、胶原/硅橡胶等材料，目前市场占有率低、使用较少。在现有的皮肤创伤修复材料中，因卡拉胶自身部分特性，至其及其衍生物很少作为原材料及相关组分应用。但卡拉胶无毒且具有良好的凝胶性能，有部分专利涉及将卡拉胶作为胶囊、果冻等材料的胶凝剂，如专利cn201510654564.1将卡拉胶处理用作植物软胶囊材料；专利cn03806246.1把κ、ι型卡拉胶处理用于非明胶胶囊壳等。技术实现要素：为了解决现有皮肤敷料的不足与技术问题，及商品级卡拉胶在应用上存在的问题，本发明的首要目的在于提供一种含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料。该敷料能为组织愈合提供一定的营养，并且在组织愈合期间保护创面、抵抗病毒防止感染的发现，同时在过程中能调节体内免疫系统部分功能，真正地起到促进创面恢复愈合的作用。本发明的另一目的在于提供上述含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料的制备方法。该方法有效的解决了不同公司的商品级卡拉胶用于生物材料制备时导致性质有所差异的问题，使所制得的支架材料稳定性得到明显的提升。本专利的再一目的在于提供上述含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料的应用。为了实现上述发明，本发明采取以下技术方案实施：一种含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料，所述的皮肤敷料是由卡拉胶和琼脂糖以(10:90)～(50:50)的质量比共混后，冷却成为凝胶再通过冷冻干燥得到的具有三维多孔层状结构的复合支架材料，或是共混后直接干燥得到的复合薄膜；所述的卡拉胶为商品级卡拉胶经过提纯处理后的卡拉胶。本发明的皮肤创收修复材料能够起到组织愈合提供一定的营养，并且在组织愈合期间保护创面、抵抗病毒防止感染的发现，同时在过程中能调节体内免疫系统部分功能，吸引中性粒细胞到达受损处，加速伤口愈合，真正地起到促进创面恢复愈合的效果。所述提纯处理步骤为：配制质量分数为10％商品级卡拉胶溶液，置于90℃水浴中加热溶解，趁热过滤；加入相同体积0.8mol/l的kcl溶液；在室温下静置或离心，取沉淀置于透析袋中透析三天，旋蒸浓缩；于-20℃冻透过夜，冷冻干燥。所述的卡拉胶为商品级卡拉胶经过提纯处理，提高所需组分纯度及去除杂质的卡拉胶。优选的，所述卡拉胶包括κ型卡拉胶、ι型卡拉胶、λ型卡拉胶中的一种。优选的，所述的三维多孔层状结构复合支架厚度为3～3.5毫米。优选的，所述的复合薄膜厚度为2～2.5毫米。上述含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料采用如下步骤制备：(1)配制质量分数为10％商品级卡拉胶溶液，置于90℃水浴中加热溶解，趁热过滤；加入相同体积0.8mol/l的kcl溶液；在室温下静置或离心，取沉淀置于透析袋中透析三天，旋蒸浓缩；于-20℃冻透过夜，冷冻干燥，备用；(2)用加热到75～90℃的纯水溶解琼脂糖，不断搅拌，得到均匀、质量浓度为1～2％的琼脂糖溶液；(3)将步骤(1)提纯的卡拉胶加入到步骤(2)中所得的琼脂糖溶液中，温度维持于75～90℃，期间搅拌混匀，得到卡拉胶/琼脂糖共混溶液，其中卡拉胶/琼脂糖的质量比为(10:90)～(50:50)；(4)将步骤(3)所得的共混溶液倒入模具中直接干燥，得到复合薄膜；或把混合溶液倒入模具中，置于-20℃环境下冰冻4～5h后冷冻干燥，得到具有三维多孔层状结构的复合支架材料。步骤(1)所述卡拉胶优选包括κ型卡拉胶、ι型卡拉胶、λ型卡拉胶之中的一种。所述卡拉胶为商品级κ-卡拉胶时，具体提纯步骤如下：配制质量分数为10％商品级κ-卡拉胶溶液，置于90℃水浴中加热溶解，趁热过滤；加入相同体积0.8mol/l的kcl溶液；在室温下静置，倾析弃去上清液；置入透析袋中透析三天，旋蒸浓缩；-20℃冻透过夜，冷冻干燥，备用。所述卡拉胶为商品级ι-卡拉胶时，具体提纯步骤如下：配制质量分数为10％ι-卡拉胶溶液，置于90℃水浴中加热至完全溶解，趁热过滤；加入相同体积0.8mol/l的kcl溶液；高速离心，弃去上清液；取沉淀物于透析袋中透析三天，旋蒸浓缩；-20℃冻透过夜，冷冻干燥，备用。所述ι-卡拉胶提纯步骤中高速离心条件为8000rpm，20min。所述卡拉胶为商品级λ-卡拉胶时，具体提纯步骤如下：配制质量分数为10％λ-卡拉胶溶液，置于90℃水浴中加热至完全溶解，趁热过滤；加入相同体积0.8mol/l的kcl溶液；高速离心，取上清液于洁净烧杯中；加入两倍体积无水乙醇，倾析；取沉淀置于透析袋中透析三天，旋蒸浓缩；-20℃冻透过夜，冷冻干燥，备用。所述λ-卡拉胶提纯步骤中高速离心条件为8000rpm，10min。优选的，步骤(1)中所述透析中使用的透析袋截留分子量为3000。优选的，步骤(2)中所述搅拌速度为600r/min。优选的，步骤(3)中所述搅拌为在75～90℃下以600r/min搅拌至混合完全为止。优选的，步骤(4)中所述的直接干燥是将模具置于20～35℃下干燥48～72h，所得含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料为复合薄膜。优选的，步骤(4)中所述的冷冻干燥是在-20～-30℃下冷冻4～5h后，于冷冻干燥机冷阱为-30～-60℃、真空的状态下抽气干燥36～48h，所得的含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料为具有三维多孔层状结构的复合支架材料。上述含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料可在皮肤敷料和组织工程支架材料领域中应用。本发明所述的室温是指0～30℃。与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：(1)本发明所提供的含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料可对创伤部位提供营养能量，且因卡拉胶特有性质，可在使用期间保护创面不受病毒感染，维持正常的愈合进程。(2)本发明所提供的商品级卡拉胶提纯方法可以分离不同种类的卡拉胶，使所需的特定卡拉胶含量得到大幅度提高，从而使使用其所制得的卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料稳定性更强，各项性质保持一致。(3)本发明所提供的含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料原料来源广泛，制造成本低，且有力于提高原料附加值，促进周围地区的海藻种植产业的发展(卡拉胶、琼脂糖皆由大型海藻中提取)。(4)本发明所提供的含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料使用简便，且具有良好的湿润性，不会对创面产生粘连，防止取出时二次创伤的发生。(5)本发明所提供的含有卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料应用范围广，可应用于烧伤，皮肤溃疡等大面积皮肤创伤修复中。且相对于琼脂糖/胶原等现有敷料，在稳定性和强度上均有所提高，本发明的敷料在生物医用材料领域更具有应用的价值。附图说明图1为实施例2制得的制得的κ型卡拉胶/琼脂糖复合支架横截面sem图。图2为实施例3所制得的ι型卡拉胶/琼脂糖复合支架横截面sem图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1一种含有λ型卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料复合薄膜，是由λ型卡拉胶与琼脂糖按照50:50的质量比所组成的复合薄膜。上述含有λ型卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料复合薄膜的制备方法包括以下步骤：(1)配制质量分数为10％商品级λ-卡拉胶溶液，置于90℃水浴中加热至完全溶解，趁热过滤。加入同体积0.8mol/l的kcl溶液。置入50ml离心管中高速离心(8000rpm、10min)，取上清液于洁净烧杯中。加入两倍体积无水乙醇，倾析。取沉淀置于截留分子量3000的透析袋中透析三天，旋蒸浓缩。置于-20℃冰箱中冻透过夜，冷冻干燥。(2)用90℃的纯水溶解琼脂糖，得到质量分数为1％的琼脂糖溶液。(3)将已提纯的λ型卡拉胶加入到上述琼脂糖溶液中，并在80℃、600r/min的条件下不断搅拌使其混合均匀，溶液无气泡，得到卡拉胶/琼脂糖共混溶液。其中卡拉胶与琼脂糖的质量比为50:50。(4)将步骤(3)所得共混溶液倒入模具中冷却，共混溶液在模具中的高度约为3毫米，然后将模具置于20～35℃条件下直接干燥36h，制得λ型卡拉胶/琼脂糖复合薄膜。取步骤(1)中提纯前后的λ-卡拉胶进行元素分析，结果如表1所示，提纯后λ-卡拉胶含量大幅提高。表1λ-卡拉胶元素分析结果λ-卡拉胶硫元素含量(％)硫酸酯基含量(％)提纯前7.2018.00提纯后9.7524.38所制得的λ型卡拉胶/琼脂糖复合薄膜厚度约为2～2.5毫米，钴60照射消毒后备用。实施例2一种含有κ型卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料复合支架，是由κ型卡拉胶与琼脂糖按照40:60的质量比所组成的复合支架材料，拉伸模量0.292mpa。上述含有κ型卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料复合支架的制备方法，包括以下步骤：(1)配制质量分数为10％商品级κ-卡拉胶溶液，置于90℃水浴中加热溶解，趁热过滤。加入同体积0.8mol/l的kcl溶液。在室温下静置，倾析弃去上清液。置入截留分子量为3000的透析袋中透析三天，旋蒸浓缩。置入-20℃冰箱中冻透过夜，冷冻干燥。(2)用90℃的纯水溶解琼脂糖，得到质量分数为1％的琼脂糖溶液。(3)将已提纯的κ型卡拉胶加入到上述琼脂糖溶液中，并在80℃、600r/min的条件下不断搅拌使其混合均匀，溶液无气泡，得到卡拉胶/琼脂糖共混溶液。其中卡拉胶与琼脂糖的质量比为40:60。(4)将步骤(3)所得共混溶液倒入模具中冷却，共混溶液在模具中的高度约为4毫米，然后将模具置于-20℃下冷冻4～5h。将冻透的模具放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-30～-60℃、真空的条件下抽气冷冻干燥36h，制得κ型卡拉胶/琼脂糖复合支架。所制得的κ型卡拉胶/琼脂糖复合支架厚度约为3～3.5毫米，钴60照射消毒后备用。对所制得的κ型卡拉胶/琼脂糖复合支架横截面进行扫描电镜观察，其横截面结构如图1所示。实施例3一种含有ι型卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料复合支架，是由ι型卡拉胶与琼脂糖按照50:50的质量比所组成的复合支架材料，拉伸模量0.321mpa。上述含有ι型卡拉胶/琼脂糖的皮肤敷料复合支架的制备方法，包括以下步骤：(1)配制质量分数为10％商品级ι-卡拉胶溶液，置于90℃水浴中加热至完全溶解，趁热过滤。加入同体积0.8mol/l的kcl溶液。置入50ml离心管中高速离心(8000rpm，20min)，弃去上清液。取沉淀物于截留分子量为3000的透析袋中透析三天，旋蒸浓缩。置入-20℃冰箱中冻透过夜，冷冻干燥。(2)用90℃的纯水溶解琼脂糖，得到质量分数为1％的琼脂糖溶液。(3)将已提纯的ι型卡拉胶加入到上述琼脂糖溶液中，并在90℃、600r/min下不断搅拌使其混合均匀，溶液无气泡，得到卡拉胶/琼脂糖共混溶液。其中卡拉胶与琼脂糖的质量比为50:50。(4)将步骤(3)所得共混溶液倒入模具中冷却，共混溶液在模具中的高度约为4毫米，然后将模具置于-20℃下冷冻4～5h。将冻透的模具放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-30～-60℃、真空的条件下抽气冷冻干燥36h，制得ι型卡拉胶/琼脂糖复合支架。所制得的ι型卡拉胶/琼脂糖复合支架厚度约为3～3.5毫米，钴60照射消毒后备用。对所制得的ι型卡拉胶/琼脂糖复合支架横截面进行扫描电镜观察，其横截面结构如图2所示。ι型卡拉胶/琼脂糖复合支架在3t3细胞毒性实验中的效果：在37℃、5％co2的条件下以0.1g/ml的浓度制备ι型卡拉胶/琼脂糖复合支架24h浸提液，把所得浸提液加入到已提前种好3t3细胞密度为1*105个/孔的24孔板中培养72h。72h后测得实验组细胞存活数与对照组无明显差异，为实验组98.7％，证明所得ι型卡拉胶/琼脂糖复合支架安全、无细胞毒性。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12