一种防治脑卒中的药物及应用的利记博彩app

本发明属于防治脑卒中药物技术领域，尤其涉及一种防治脑卒中的药物及应用。

背景技术：

脑卒中(stroke)又称脑血管意外或中风，是因脑血管阻塞和破裂引起的脑血流循环障碍和脑组织功能或结构损害为表现的急性脑血管疾病。缺血性脑卒中在发达国家和发展中国家发病率、致残率和死亡率均很高的常见神经系统疾病，在老龄化形势日渐严重的国家中，缺血性脑卒中占了大约85-90％的比例。当前是我国致死或致残的主要原因之一，发病原因较为复杂，目前影响其发病的原因主要从遗传和环境两个角度考虑。遗传变异可能是缺血性脑卒中的的重要发病原因。众多研究表明，缺血性脑卒中不是一种单基因遗传病，其发病原因受环境暴露与多基因交互影响的复杂疾病。然而，与其相关的众多基因还有待进一步确定与研究。

目前临床治疗脑卒中的方法主要是服用阿司匹林、氯比格雷、脑活素片、弥可保等，都是疗效比较可靠，有治疗针对性的用药，其中阿司匹林是防治脑卒中的基础用药，对防止脑卒中复发有一定疗效，虽然以上治疗方法效果明显，但是可产生多种副作用对人体造成损伤。但临床应用阿司匹林显示有47％的患者存在用药抵抗，即使是阿司匹林肠溶片，也会对胃肠造成负担和影响。维格列汀是目前治疗2型糖尿病药物的主要药物之一。维格列汀片(vildagliptin)是欧盟委员会临床获批准用于治疗2型糖尿病的DPP-4抑制剂，于2007年在27个欧盟国家及爱尔兰上市，2007年也获得欧盟批准用于治疗2型糖尿病。目前维格列汀片已成为美国口服糖尿病药物的第二大药物。目前没有应用维格列汀应用于治疗脑卒中的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种防治脑卒中的药物及应用，旨在解决目前临床治疗脑卒中的方法存在产生多种副作用对人体造成损伤的问题。

本发明是这样实现的，一种防治脑卒中的药物，所述防治脑卒中的药物为维格列汀片。

本发明的另一目的在于提供一种所述防治脑卒中的药物在防治脑卒中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种验证防治脑卒中的药物的局灶脑缺血模型，所述局灶脑缺血模型为：

选取60只雄鼠SPF级SD大鼠，体重在220-250g，随机分为3组，每组20只；正常组、生理盐水组、维格列汀组；单侧颈总动脉不全结扎法采用单侧颈总动脉不全结扎制备局灶性脑缺血大鼠模型；室温条件下，大鼠称重后，用10％水合氯醛3mlPkg，腹腔麻醉后，脊位固定在手术台上，颈部备皮，常规消毒后行正中切口，钝性分离肌肉，找出单侧颈总动脉，用9号丝线不全结扎单侧颈总动脉，缝合切口；每天用青霉素4万u腹腔注射以抗感染，连用3d；实验组和生理盐水组分别经过灌胃给药方式给予维格列汀和生理盐水，正常组不作任何处理；通过Bederson神经功能评分和肌力测定实验检测三组之间在神经行为方面是否存在差异。

本发明提供的防治脑卒中的药物及应用，防治脑卒药物有效成分明确，成本较低，易于实施；目前临床治疗脑卒中的药物效果明显。

附图说明

图1是本发明实施例提供的Morris水迷宫检测三组大鼠学习记忆功能示意图；

图中：A为三组之间潜伏期统计分析结果，**p<0.01，***p<0.001；

B为三组分别在目标象限游泳的时间，**p<0.01。

图2是本发明实施例提供的尼氏染色检测神经元示意图；

图中：A、B图正常对照组尼氏染色；C、D图维格列汀组尼氏染色；E、F图生理盐水组尼氏染色。

图3是本发明实施例提供的免疫组化检测大鼠海马区BDNF表达示意图；

图中：正常组、维格列汀组、生理盐水组海马区BDNF表达。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的防治脑卒中的药物为维格列汀片。

本发明的防治脑卒中的药物在防治脑卒中的应用。

下面结合具体实施例对本发明的应用效果作详细的描述。

为了验证上述用途，本发明采用了以下技术措施：

A、首先，建立了局灶性缺血脑卒中动物模型，实验分为三组正常组、维格列汀组、生理盐水组。随后对各组大鼠进行Bederson神经功能评分和肌力测定，并进行统计分析。实验表明，维格列汀组可以有效缓解及改善脑缺血大鼠的神经功能。

B、其次，检测了维格列汀对脑卒中大鼠的学习记忆功能的影响。有关文献表明，脑卒中可以损伤大鼠的学习记忆功能。随后进行经典的Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆功能。实验表明，维格列汀可以有效改善脑缺血大鼠的学习记忆功能。

C、大鼠脑部海马组织神经元凋亡检测。脑卒中可以影响大鼠海马神经元状态，通过尼氏染检测海马组织中神经元凋亡情况。并且它也通过产生兴奋性氨基酸、炎症介质，降低缝隙连接等损伤神经元。实验结果表明维格列汀在脑缺血过程中对神经元起到一定的保护作用。

D、大鼠脑部海马组织BDNF表达变化检测。利用免疫组化方法检测大鼠海马区域神经保护因子—脑源性神经营养因子的表达(BDNF)，BDNF表达的强弱及多少反映了脑缺血状态的程度。研究显示，脑缺血后BDNF表达升高。实验结果表明，维格列汀对神经元起到一种保护作用，可以有效抑制脑源性神经营养因子的表达。

实施例1：维格列汀可以有效改善脑缺血动物神经功能损伤症状

(1)选取60只(雄鼠)SPF级SD大鼠，体重在220-250g，随机分为3组(每组20只)正常组、生理盐水组、维格列汀组。首先建立了局灶性缺血脑卒中动物模型，实验组和生理盐水组分别经过灌胃给药方式给予维格列汀和生理盐水，正常组不作任何处理。通过Bederson神经功能评分和肌力测定实验检测三组之间在神经行为方面是否存在差异。

首先参照Bederson等的方法制备局灶脑缺血模型方法如下：单侧颈总动脉不全结扎法采用单侧颈总动脉不全结扎制备局灶性脑缺血大鼠模型。室温条件下，大鼠称重后，用10％水合氯醛3mlPkg，腹腔麻醉后，脊位固定在手术台上，颈部备皮，常规消毒后行正中切口，钝性分离肌肉，找出单侧颈总动脉，用9号丝线不全结扎单侧颈总动脉，缝合切口。每天用青霉素4万u腹腔注射以抗感染，连用3d。

实验分为两部分：

(1)Bederson神经功能评分：将大鼠提尾悬空，高于桌面10cm，正常大鼠表现为头抬起，两个前爪伸向桌面。脑损伤大鼠表现为脑损伤对侧前肢屈曲，姿势变化从轻度屈腕、伸肘，到严重的腕肘屈曲。Bedson评分标准根据大鼠姿势反射和肩部侧向推力实验结果分为4个等级记分：

0分：未观察到神经功能缺失症状；

1分：提尾悬空时梗死半球对侧前肢屈曲，但不伴有其他异常；

2分：提尾悬空时梗死半球对侧前肢屈曲，用手推梗死半球对侧肩部，其抵抗力减弱，但自由活动时不转圈；

3分：同2分行为，且自由后动时向瘫痪侧转圈。

(2)肌力测定：取直径为0.15cm的铁丝，长100cm，在距地面70cm处水平固定其两端，其下放厚5cm的海绵垫以避免大鼠掉下时摔伤。让大鼠两前爪放在铁丝绳上后松手，观察大鼠的行为并记录其在绳上的悬吊时间。根据大鼠的肢体放置情况和悬挂时间，分为4个等级记分。即0分：挂在绳上0-2s；1分：挂在绳上3-4s；2分：挂在绳上超过5s；3分：挂在绳上超过5s，并可将后肢放在绳上。

上述实验结果表明，与维格列汀组和正常对照组比，生理盐水组大鼠的神经功能均造成显著性损伤。维格列汀组神经功能与正常对照组无显著差异。维格列汀可促进脑缺血大鼠瘫痪肢体肌力恢复。结果见表1和表2。

实施例2：维格列汀对脑缺血大鼠学习记忆功能和空间认知功能检测实验

(1)选取60只(雄鼠)SPF级SD大鼠，体重在220-250g，随机分为3组(每组20只)正常组、生理盐水组、维格列汀组。通过Morris水迷宫方法检测维格列汀组和生理盐水组及正常组学习记忆功能和空间认知功能。实验用水槽为镀锌圆槽，直径150cm，高50cm，池内水深25cm，水温22—23℃，水中加入墨汁，使水池不透明。将水池划分为四个象限，在某个象限中点距池边25cm处放置一高23.5cm、直径8cm的平台，隐于水面下1.5cm。

实验分为两部分：

(1)定位航行实验：主要是检测大鼠学习记忆功能。

实验前一天下午让大鼠在水槽中自由游泳2min，以熟悉环境。实验共进行4天，每天上、下午各进行4次试验(每只大鼠随机从每个象限的中点面壁式入水1次)，大鼠入水后尽力逃避水患，当发现站台后则栖身其上，图像采集及分析系统(EthoVision 3.0)自动记录保存大鼠的运动轨迹、找到站台的潜伏期(大鼠从入水至攀上平台的时间)、游泳时间、游泳速度、游泳距离及寻找站台的搜索战略等信息。若120秒仍未找到站台，由操作者将大鼠引上站台上休息4秒钟并将潜伏期记为120秒。

(2)空间探索实验：主要是检测动物空间认知能力。

第4日下午完成4次定位航行之后将站台撤除，进行空间探索试验。选定和站台区域相对的象限中点为入水点，大鼠以面壁方式入水，记录大鼠120秒内搜索站台穿过原站台区域的次数。

上述实验结果表明，与正常对照组和维格列汀相比，生理盐水组大鼠在潜伏期与目标象限所在时间学习记忆功能和空间认知能力均造成显著性损伤。维格列汀组的记忆功能和认知能力与正常对照组无显著差异。结果见图1。

实施例3：尼氏染色检测神经元状态实验

尼氏体是反映神经元状态的一个指标：在正常生理情况下，尼氏体大而数量多，反映神经细胞合成蛋白质的功能较强，在神经元受损时，尼氏体的数量可减少甚至消失。

实验步骤如下：

(1)组织切片:生理盐水组、维格列汀组大鼠分别于脑缺血造模结束后立即灌注取材。用戊巴比妥(400mg/kg)腹腔注射麻醉后，按常规方法4％多聚甲醛左心室灌注固定取脑。具体方法:将大鼠仰卧固定于解剖板上，剑突下开胸暴露心脏，找到心尖部，直视下将磨钝的穿刺针经左心室插入升主动脉，在右心耳剪开一小口放血，同时打开输液器开关，先用100-200ml冷生理盐水(NS)快速灌注，之后稍减慢灌速度冲洗至流出液清亮，随后换用4％多聚甲醛/PBS(pH7.4)约100mL迅速灌之后稍减慢灌注速度继续固定。在灌注过程中，可以观察到大鼠全身肌肉颤动，逐渐僵硬、强直，此时断头取脑，置入上述固定液中后固定24h，再移入25％蔗糖PBS中4℃浸泡至组织沉底。在大脑视交叉与视乳头之间冠状切取2-5mm³组织，断面可见白色纤维状物，即是海马。随后将组织包埋、快速冰冻，在冰冻切片上做连续冠状切片。切片厚度30um，封片晾干备用。

(2)每组取6张石蜡切片常规脱蜡下水预处理。

(3)将石蜡切片放入缓冲亚甲蓝染色液内染10min。

(4)在0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH＝4.6)中分化1-3秒，并在显微镜下观察，尼氏体清晰时进行下一步试验。

(5)用4wt％的钼酸铵水溶液处理切片3-5min。

(6)蒸馏水洗脱后常规脱水透明、中性树胶封片。

(7)光学显微镜(×200)观察海马CA1区尼氏体的变化。

(8)实验结果显示：维格列汀组(图2-C、D)大鼠海马CA1区较正常对照组(图2-A、B)尼氏体无明显差异，神经元尼氏体层次较致密但不紊乱，细胞大而圆胞体形状良好。生理盐水组(图2-E、F)较正常对照组海马神经元尼氏体轻微减少，胞质稍有淡染，海马分层稀疏紊乱。以上结果表明：生理盐水组大鼠的海马神经元严重受损，实验组大鼠海马神经元状态无明显受损。

实施例4：蛋白免疫印迹检测脑缺血大鼠海马区BDNF表达变化

实验步骤如下：

(1)电泳凝胶的制备：分离胶的浓度根据所检测的目的蛋白的分子量的大小决定，一般来说，目的蛋白的分子量越小则所需要的分离胶浓度就越高。目的蛋白为BDNF，分子量为13KD。

(2)样品处理及上样：采用BCA法测定所需目的蛋白浓度后，加入5×SDS上样缓冲液，放入100℃沸水中煮10min。然后在涡旋器上振荡20s，用微量加样枪吸取蛋白样品加入各泳道，上样体积根据不同组蛋白含量而定，以保证各组加样目的蛋白总量保持一致。

(3)目的蛋白凝胶电泳分离：加样完毕后先用80V电泳约30min，待溴酚蓝指示剂移动至浓缩胶与分离胶交界处成线状时，改为恒压(150V)电泳约90min至溴酚蓝到凝胶底部停止。

(4)转膜：将蛋白质从SDS-PAGE凝胶上转移至PVDF膜上，转移电流为恒流275mA，电压一般在80-130V(电压低于90V将影响转移效果，可以适当补充甲醇提高电压)，具体转移时间根据所需要转移的目的蛋白质的分子量的大小决定。一般来说，转移的目的蛋白的分子量越小则所需要转膜的时间就越短。BDNF蛋白转移时间约为1h。

(5)蛋白免疫印迹显色(ECL显色系统)：将PVDF膜用含5％BSA的1×TBS封闭液于室温振荡封闭1h；取出PVDF膜，加入稀释的一抗(BDNF抗体1:2000稀释；一抗稀释液为含5％BSA的1×TBS)，4℃孵育过夜；1×TBS缓冲液(50mM Tris-Cl)洗膜3次，每次5min；滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(稀释倍数为1:5000)，37℃孵育1h；1×TBS缓冲液洗膜3次，每次10min；准备显色液(将Thermo ECL显色液试剂中增强液和稳定的过氧化酶溶液按1:1比例进行混合，大约200ul)；滴加配置好的工作液于PVDF膜上，将PVDF膜放于ECL显色系统中，调整曝光时间，保存图像随后将PVDF膜保存保鲜袋中，可放4℃保存。

(6)蛋白免疫印迹结果显示：正常组与维格列汀组BDNF表达无明显差异。生理盐水组BDNF阳性表达明显升高(如图3所示)。

综上所述，维格列汀化合物可有效治疗脑缺血动物神经功能恢复，且可有效的改善脑卒中大鼠的学习记忆功能，对神经元起到一种保护作用。

表1维格列汀对脑缺血大鼠神经功能的影响

表2维格列汀对对脑缺血大鼠肌力的影响

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。