生物蛋白胶‑曲安奈德缓释剂及制备方法和应用与流程

本发明涉及缓释制剂领域，特别涉及生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂及制备方法和应用。

背景技术：

食管癌是起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，在全球范围内食管癌的发病率在恶性肿瘤中居第8位，死亡率为第6位。我国是食管癌最高发的国家之一，国内每年食管癌新发病例超过22万例，死亡约20万例，通常食管癌患者确诊时已进展至中晚期，总体5年生存率不足20％，而早期食管癌通常经内镜下微创治疗即可根治，5年生存率可超过95％。目前，内镜下粘膜切除术(Endoscopic mucosal resection EMR)和内镜下粘膜剥离术(endoscopic submucosal dissection ESD)是早期食管癌的主要治疗方式。但是，EMR和ESD通常会破坏患者食管粘膜层，导致食管狭窄。研究表明，大于四分之三周的食管粘膜剥离，术后食管狭窄的发生率即高达88-100％，对患者的生活质量造成严重的影响。

通过机械方法扩张狭窄部位，能够在较短时间内为患者解除痛苦。但是，食管狭窄容易复发，需进行多次介入治疗，这无疑会增加消化道内壁的损伤和并发症的发生，导致瘢痕形成，形成食管狭窄。食管狭窄是由于固有肌层的破坏和纤维化导致的，黏膜层炎症反应的缺失将会避免固有肌层的损害及过度纤维化从而预防食管狭窄。类固醇激素能减少脯氨酰羟化酶的活化，促进胶原酶的激活来减轻炎症反应从而减少组织胶原的含量。基于这一理念，发现ESD术后内镜下曲安奈德的注射可以有效预防食管狭窄的发生。但是，局部类固醇药物的注射往往需要在介入设备的辅助下多次用药，这无疑会增加患者的痛苦和经济负担，不同手术的创面范围、注射方式和注射剂量，也会带来不一样的疗效，同时，多次注射会有穿刺出血的风险。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂及制备方法和应用，通过内镜直接喷涂缓释剂在消化道相应手术区域处，能发挥持久抗炎作用，减少术后瘢痕形成，预防术后食管狭窄，有效改善患者生活质量。

本发明提供的一种技术方案是：一种生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂，缓释剂包含生物蛋白胶、抑肽酶、曲安奈德，其中，生物蛋白胶的质量分数为1.8％～4.0％，抑肽酶的质量分数为0.08％～0.10％，曲安奈德的质量分数为0.09％～0.33％。

上述缓释剂的制备方法，具有以下步骤，

1)取抑肽酶，溶解配置成质量浓度为10％的抑肽酶溶液；

2)取曲安奈德，溶解配置成浓度为10mg/ml的曲安奈德溶液；

3)分别配置生物蛋白主体胶溶液、催化剂溶液，其中，生物蛋白主体胶溶液浓度为50～90mg/ml，催化剂溶液浓度为500IU/ml；

4)取1体积步骤3)配置的生物蛋白主体胶溶液、0.01体积步骤1)配置的抑肽酶溶液、0.125～0.375体积步骤2)配置的曲安奈德溶液，混匀；

5)取1体积步骤3)配置的催化剂溶液、0.01体积步骤1)配置的抑肽酶溶液、0.125～0.375体积步骤2)配置的曲安奈德溶液，混匀；

6)将步骤4)、步骤5)的混合液混合，凝结，得到生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂。

上述步骤1)用生理盐水溶解抑肽酶，步骤2)用灭菌注射用水溶液曲安奈德。

上述缓释剂在制备模拟生物体内缓释曲安奈德制剂的用途。

本发明提供的另一种技术方案是：一种生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂，缓释剂包括生物蛋白胶、曲安奈德，其中，生物蛋白胶的质量分数为2.5％～4.5％，曲安奈德的质量分数为0.13％～0.38％。

上述缓释剂的制备方法，有以下步骤：

1)取曲安奈德，溶解配置成浓度为10mg/ml的曲安奈德溶液；

2)用步骤1)配置的曲安奈德溶液作溶剂，配置浓度为50～90mg/ml的生物蛋白主体胶溶液；

3)配置浓度为500IU/ml的催化剂溶液；

4)将步骤2)所得生物蛋白主体胶溶液与步骤3)所得催化剂溶液等体积混合，凝结，得到生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂。

上述步骤1)用灭菌注射用水溶解曲安奈德。

上述缓释剂在制备用于防治消化道内镜治疗术后狭窄的制剂中的用途。

本发明具有以下有益效果：

生物蛋白胶提取自生物组织内，由纤维蛋白原、凝血因子及凝血酶等多种可凝性蛋白组成，其本身具有止血、封闭创面、黏合裂口、促进愈合的作用。生物蛋白胶植入体内后，根据局部纤溶活性及生物蛋白胶体积，可在8～18d内被组织降解吸收，毒副作用较小，不存在异物残留问题，避免了某些生物材料植入后需二次手术取出的问题。

曲安奈德属于类固醇激素，被应用于预防食管ESD术后狭窄。

将曲安奈德与生物蛋白主体胶混匀后，再与催化剂混合，模拟发生生物体凝血反应，形成凝胶状的纤维蛋白多聚体，曲安奈德均匀分布在该纤维蛋白多聚体内。纤维蛋白多聚体具有稳定及特定的海绵状三维结构，表面积较大，可延长自身溶解时间与曲安奈德释放时间，在三维结构内构建成多个小室间，形成类似半透膜的结构，曲安奈德均匀分布在纤维蛋白多聚体的各小室间内，可顺浓度梯度方向自半透膜不断从小室间向外渗透，实现缓释曲安奈德的目的，持续对患者手术区域处给药，有效避免了传统治疗手段通过介入设备辅助多次用药的缺陷。此外，生物蛋白胶还具有抗压性、形状可塑性等优点，结合消化道的管道特点，非常适合用于对消化道用药。

当在生理盐水中模拟生物体内缓释曲安奈德时，制备缓释剂过程中加入的抑肽酶用于减缓蛋白胶凝结速度，使曲安奈德均匀分布在生物蛋白胶内，能有效保证曲安奈德缓释的平顺性。

本发明制备得到的生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂，能发挥持久抗炎作用，减少术后瘢痕形成，有效预防食管术后狭窄，减少手术并发症。为一次性给药，减少患者接受治疗的次数，减轻患者负担，有效改善患者的生活质量。

本发明所用生物蛋白胶，购自上海莱士血液制品股份有限公司(催化剂：每瓶1000IU，2ml/瓶，主体胶：每瓶100-180mg，2ml/瓶)；醋酸曲安奈德注射液(5ml∶50mg)，购自天津金耀氨基酸有限公司；抑肽酶，购自上海雅心生物技术有限公司；THZ-9213型台式恒温振荡器，购自上海跃进医疗器械厂；灭菌注射用水，购自四川科伦药业股份有限公司；生理盐水，购自西南药业股份有限公司。

说明书附图

图1为色谱测定图，图中，A为生理盐水+抑肽酶溶液的色谱图，B为醋酸曲安奈德注射液的色谱图，C为曲安奈德+生理盐水+抑肽酶溶液的色谱图；

图2为缓释剂在37℃生理盐水中曲安奈德释放曲线图，图中，A表示含2.5mg曲安奈德缓释剂，B表示含5.0mg曲安奈德缓释剂，C表示含7.5mg曲安奈德缓释剂。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：制备生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在无菌无酶环境中用900μl生理盐水溶解，充分混匀，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主体胶溶液

按照购买的医用生物蛋白胶使用说明书，用配套的主体胶溶液溶解主体胶，得到生物蛋白主体胶溶液；

3)配置催化剂溶液

按照购买的医用生物蛋白胶使用说明书，用配套的氯化钙溶液溶解催化剂(凝血酶)，得到催化剂(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步骤2)配置的生物蛋白主体胶溶液1ml、步骤1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.125ml醋酸曲安奈德注射液，混匀；取配套的第二注射器，抽取步骤3)配置的催化剂溶液1ml、步骤1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.125ml醋酸曲安奈德注射液，混匀；将第一注射器、第二注射器的锥头部牢固地连接在连接针座上，再将各注射器的喷嘴安装在连接针座的锥头上，检查无松动渗漏后，同时推挤第一注射器、第二注射器，注入准备好的透明薄袋里(透明薄袋底面积为2.0cm×2.0cm)，迅速凝结形成生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂(含曲安奈德2.5mg)。

实施例二：制备生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在无菌无酶环境中用900μl生理盐水溶解，充分混匀，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主体胶溶液

按照购买的医用生物蛋白胶使用说明书，用配套的主体胶溶液溶解主体胶，得到生物蛋白主体胶溶液；

3)配置催化剂溶液

按照购买的医用生物蛋白胶使用说明书，用配套的氯化钙溶液溶解催化剂(凝血酶)，得到催化剂(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步骤2)配置的生物蛋白主体胶溶液1ml、步骤1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml醋酸曲安奈德注射液，混匀；取配套的第二注射器，抽取步骤3)配置的催化剂溶液1ml、步骤1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml醋酸曲安奈德注射液，混匀；将第一注射器、第二注射器的锥头部牢固地连接在连接针座上，再将各注射器的喷嘴安装在连接针座的锥头上，检查无松动渗漏后，同时推挤第一注射器、第二注射器，注入准备好的透明薄袋里(透明薄袋底面积为2.0cm×2.0cm)，迅速凝结形成生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂(含曲安奈德5.0mg)。

实施例三：制备生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在无菌无酶环境中用900μl生理盐水溶解，充分混匀，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主体胶溶液

按照购买的医用生物蛋白胶使用说明书，用配套的主体胶溶液溶解主体胶，得到生物蛋白主体胶溶液；

3)配置催化剂溶液

按照购买的医用生物蛋白胶使用说明书，用配套的氯化钙溶液溶解催化剂(凝血酶)，得到催化剂(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步骤2)配置的生物蛋白主体胶溶液1ml、步骤1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.375ml醋酸曲安奈德注射液，混匀；取配套的第二注射器，抽取步骤3)配置的催化剂溶液1ml、步骤1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.375ml醋酸曲安奈德注射液，混匀；将第一注射器、第二注射器的锥头部牢固的连接在连接针座上，再将各注射器的喷嘴安装在连接针座的锥头上，检查无松动渗漏后，同时推挤第一注射器、第二注射器，注入准备好的透明薄袋里(透明薄袋底面积为2.0cm×2.0cm)，迅速凝结形成生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂(含曲安奈德7.5mg)。

实施例四：制备生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂

1)配置生物蛋白主体胶溶液

按照购买的医用生物蛋白胶使用说明书，取生物蛋白主体胶，用醋酸曲安奈德注射液作溶剂，溶解得到生物蛋白主体胶溶液；

2)配置催化剂溶液

按照购买的医用生物蛋白胶使用说明书，用配套的氯化钙溶液溶解催化剂(凝血酶)，得到催化剂(凝血酶)溶液；

3)取配套的第一注射器，第二注射器，分别抽取等体积的步骤1)配置的生物蛋白主体胶溶液和步骤2)配置的催化剂溶液，将第一注射器、第二注射器的锥头部牢固的连接在连接针座上，再将各注射器的喷嘴安装在连接针座的锥头上，检查无松动渗漏后，同时推挤第一注射器、第二注射器，注入准备好的透明薄袋里(透明薄袋底面积为2.0cm×2.0cm)，迅速凝结成白色胶冻样的生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂。

实施例五：制备生物蛋白胶空白对照组

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在无菌无酶环境中用900μl生理盐水溶解，充分混匀，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主体胶溶液

按照购买的医用生物蛋白胶使用说明书，用配套的主体胶溶液溶解主体胶，得到生物蛋白主体胶溶液；

3)配置催化剂溶液

按照购买的医用生物蛋白胶使用说明书，用配套的氯化钙溶液溶解催化剂(凝血酶)，得到催化剂(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步骤2)配置的生物蛋白主体胶溶液1ml、步骤1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml生理盐水，混匀；取配套的第二注射器，抽取步骤3)配置的催化剂溶液1ml、步骤1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml生理盐水，将第一注射器、第二注射器的锥头部牢固的连接在连接针座上，再将各注射器的喷嘴安装在连接针座的锥头上，检查无松动渗漏后，同时推挤第一注射器、第二注射器，注入准备好的透明薄袋里(透明薄袋底面积为2.0cm×2.0cm)，迅速凝结形成生物蛋白胶空白对照组(不含曲安奈德)。

体外缓释实验：

将实施例一、二、三、五制备得到的生物蛋白胶分别置于四个烧杯中，各烧杯分别加入生理盐水5ml，用THZ-9213型台式恒温振荡器于37℃恒温振荡，每隔12h(即12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h)吸取释放液5ml，并补充生理盐水5ml，继续振荡。

色谱分析：

色谱分析条件：色谱柱(Water×BridgeC18，4.6mm×15mm，5μm)；流动相为水：甲醇＝30∶70；进样量：20μl；柱温：30℃；检测波长：240nm；流速：1ml/min。

专属性试验

按上述色谱分析条件分别色谱分析测定生理盐水+抑肽酶溶液、醋酸曲安奈德注射液、曲安奈德+生理盐水+抑肽酶溶液，并获得如图1所示色谱图。通过观察图1所得色谱峰可知，本试验方法特异性较好，曲安奈德保留时间约为8.6min，未检测到其他物质对生物蛋白胶内曲安奈德测定的干扰。

线性曲线方程

分别用灭菌注射用水配置浓度(X)为0.05μg/ml、0.10μg/ml、1.00μg/ml、10.00μg/ml、50.00μg/ml的5个浓度梯度的曲安奈德溶液，按上述色谱分析条件进行色谱分析测定，以峰面积Y为应变量，浓度X(μg/ml)为自变量，通过线性回归算得回归方程：Y＝63362X-10006(r＝0.9999，n＝5)。将色谱峰面积带入回归方程计算相应浓度C，并计算浓度偏差(D＝(C-X)*100％)，以偏差在5％内确定最低检测限。结果表明，曲安奈德在0.05～50μg/mL范围内线性良好。

精密度实验

用灭菌注射用水配置浓度为5μg/ml的曲安奈德溶液。按上述色谱分析条件进行色谱分析测定。单日内每隔3h测定3次，共测定3批；日间于每日同一时间测定3次，连续测定3d，其结果见表1。日内平均相对标准偏差(RSD)为0.95％，日间平均相对标准偏差(RSD)为0.77％。

表1：精密度测试结果 (n＝3)

稳定性实验

任取体外缓释实验的同一释放液，放入冰箱于4℃保温，分别于0，2，4，6，8，10，15，20，30d时按上述色谱分析条件进行色谱分析检测，根据得到的回归方程计算其曲安奈德的含量，结果显示RSD＝0.83％(n＝9)，表明释放液在30d内稳定。

重复性实验

取同一释放液，分成6份，配置成6份平行样本，按上述色谱分析条件进行色谱分析检测，根据得到的回归方程计算其曲安奈德的含量，结果显示RSD＝1.01％，(n＝6)，表明该方法重复性良好。

体外释放率

按照上述色谱分析条件，分别色谱分析体外缓释试验所得释放液，算得色谱峰面积，代入得到的回归方程，得到各样本溶液浓度。再根据累积释放率公式得到曲安奈德的累积释放率，累积释放率＝(∑CV)/M，其中C为根据回归方程计算得到的各样本释放液中曲安奈德浓度，V为各样本释放液体积，M为溶解入生物蛋白胶内曲安奈德的质量。以累计释放率为纵坐标(Y轴)，以时间为横坐标(X轴)，做一如图2所示体外累计释放率曲线。由图2可知，生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂可在外界环境温度为37℃的条件下，在生理盐水中持续稳定释放，缓释时长长达120h。表明曲安奈德在生物蛋白胶中的缓释效果有良好的稳定性和时效性。

施药方法：

将实施例四制备得到的生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂装入内镜配套的喷涂装置内，内镜管道沿内镜活检孔道伸入，内镜管道外口与喷涂装置相连，内镜管道内口在直视下对应患者消化道指定部位，即可对指定部位喷涂生物蛋白胶-曲安奈德缓释剂。