土槿乙酸在制备抗肺纤维化药物中的应用的利记博彩app

本发明涉及土槿乙酸在制备抗肺纤维化药物中的应用。

背景技术：

特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis，ipf)是指肺泡上皮细胞受到损伤后异常修复，致使肺成纤维细胞增殖向肌成纤维细胞转化，细胞外基质分泌过多，胶原沉积，肺泡结构改变，最终形成纤维化。其发病机制尚未完全明确，目前研究认为与氧化应激、炎症反应、体液调节肾素—血管紧张素—醛固酮系统(raas)密切相关^[1-3]。氧化应激产生过多的ros导致肺上皮细胞坏死诱发炎症反应及细胞因子网络失调促进白细胞介素、转化生长因子β1(tgf-β1)、结缔组织生长因子(ctgf)等增加，炎症反应又会产生活性氧代谢产物及一系列炎性介质加重炎症及肺上皮细胞坏死，形成恶性循环，使肺纤维化进行性加重^[4]。目前认为raas系统在肺纤维化进程中扮演重要角色，血管紧张素转化酶(angiotensinconvertingenzyme，ace)可以将血管紧张素ⅰ(angiotensinⅰ，angⅰ)水解为血管紧张素ⅱ(angiotensinⅱ，angⅱ)，angⅱ在各种炎症的发生、发展过程中发挥着重要的作用。而醛固酮可以刺激细胞有丝分裂与胶原合成，促进组织细胞增长，增加胶原蛋白沉积，增强组织的修复能力。患者被诊断为ipf，从呼吸衰竭到死亡不到3年时间，5年生存率约为20％，目前治疗仍没有特效药^[1]。

土槿乙酸(pseudolaricacidb，plab)是从我国松科植物金钱松(pseudolarixkaempferigord)的根皮及近根皮(土槿皮)中分离出的主要成分之一，为二萜类化合物。天然产物中许多具有此类结构的化合物具有显著的抗肿瘤作用^[5-6]。plab还具有显著的抗真菌活性^[7-8]。目前，尚未有土槿乙酸在制备抗肺纤维化药物中应用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种土槿乙酸在制备抗肺纤维化药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种含土槿乙酸的制剂在制备抗肺纤维化药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

土槿乙酸在制备抗肺纤维化药物中的应用，所述土槿乙酸结构式(i)所示：

含土槿乙酸的制剂在制备抗肺纤维化药物中的应用，所述含土槿乙酸的制剂的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂或针剂。

实验证明，土槿乙酸(pseudolaricacidb，plab)明显减轻博莱霉素构建的肺纤维化模型小鼠的肺泡炎及肺纤维化程度，可抑制纤维化的肺组织中il6/tgf-β1/p-smad2通路的表达，使肺组织中胶原分泌，α-sma及tgf-β1、p-smad2蛋白表达明显减少，从而治疗及预防肺纤维化。

附图说明

图1土槿乙酸作用后小鼠肺组织病理切片(×200)。

图2土槿乙酸作用后小鼠肺组织病理切片评分。

图3各组小鼠肺组织masson染色观察(×200)。

图4土槿乙酸作用后小鼠肺组织masson染色评分。

图5土槿乙酸作用后各组血清il-6含量。

图6土槿乙酸作用后各组血清tnf-α含量。

图7土槿乙酸作用后小鼠肺组织胶原ⅲ的影响。

图8土槿乙酸作用后小鼠肺组织胶原ⅲ的影响。

图9土槿乙酸作用后小鼠肺组织α-sma的影响。

图10土槿乙酸作用后小鼠肺组织tgf-β1的影响。

图11土槿乙酸作用后小鼠肺组织p-smad2的影响。

具体实施方式

下面的实施方案和方法可以使专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明

土槿乙酸提取方法如下：

用体积浓度为95％的乙醇水溶液加热回流从土槿皮中提取得到粗品，再用乙酸乙酯萃取粗品，得到乙酸乙酯萃取层。然后通过硅胶柱进行分离纯化。经薄层色谱分析，选择流动相的洗脱比例：silicacc(φ35cm,2.5cm)，石油醚：乙酸乙酯＝6:1，分离得到纯品plab(90％)。

药理实验数据：

土槿乙酸在制备抗肺纤维化药物中作用的研究：

1材料与方法

1.1实验动物及材料

4周龄spf级雄性昆明小鼠40只(北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重(21±2.0)g；

土槿乙酸白色粉末，给药前用生理盐水配制；

吡非尼酮：天津金耀药业有限公司(国药准字h12020392)；

注射用盐酸博莱霉素，日本化药株式会社,批号640412，药品进口注册证号：h20090885；

超氧化物歧化酶(sod)测试盒、谷胱甘肽(gsh)试剂盒和羟脯氨酸(hyp)试剂盒均购自南京建成工程研究所；

tgf-β1兔多克隆抗体(ab92486)、p-smad2兔单克隆抗体(ab188334)、α-sma兔单克隆抗体(ab23575)购于abcam公司；

二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1分组及造模小鼠随机分为4组：对照(n)组、模型(m)组、阳性药吡非尼酮(p)组、土槿乙酸(t)组，每组10只。

n组气管内滴入0.9％氯化钠注射液，其余各组小鼠经气管给予博来霉素溶液5mg·kg-1建立肺纤维化模型。

造模后第2天组给予吡非尼酮(50mg·kg^-1·d^-1)、土槿乙酸(5mg·kg^-1·d^-1)灌胃。n组与m组灌等体积0.9％氯化钠注射液。

1.2.2标本获取与分析于治疗后的第21天每组处死10只取材。各组小鼠眼球取血，留取血清做检测。然后脱颈处死快速打开小鼠胸腔，切取右肺中叶，4％中性甲醛固定，做he染色和masson染色病理切片。剩余肺组织-80℃冻存作相关指标测定。

1.2.3肺组织病理学观察观察肺组织形态，参照szapiel等方法，对肺组织he染色结果进行肺泡炎症评分。

肺泡炎分级及评分标准:

0级：无肺泡炎，记0分；

1级：轻度肺泡炎，镜下见肺泡隔浸润而增厚，但病变范围不超过全肺20％，肺泡结构未发生明显变化，记1分；

2级：中度肺泡炎，肺泡炎症病变面积占全肺的20％-50％，记2分；

3级：重度肺泡炎，病变范围超过全肺面积的50％，肺泡腔可见炎性细胞及红细胞，记3分。

用imageproplus软件对masson染色结果进行图像分析，每张切片随机选取5个不重叠视野(×200)，评价肺纤维化程度。肺纤维化程度＝肺纤维化面积/肺组织面积×100％。

1.2.4血清中il-6和tnf-α检测实验完成的时候，眼球取血，离心留存血清，检测步骤严格按照试剂盒提供的说明书进行。

1.2.5rt-pcr检测肺组织iii型胶原mrna表达trizol法提取各组肺组织总rna，核酸定量仪测定各组总rna的质量浓度(μg/ml)和纯度(a260/a280，1.8～2.0之间)，定量后逆转录合成cdna(-20℃保存)，扩增时反应体系中加入taq酶6μl、rnase-freeddh2o3μl、cdna1μl、目的基因上下游引物各1μl以及内参β-actin上下游引物各1μl，共12μl体系。设定好预变性、变性、退火和延伸各个阶段温度以及循环次数等条件后进行扩增。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，随后凝胶成像系统测定各组条带灰度值，将目的基因条带灰度值与β-actin做比较，计算各样本目标基因的相对表达情况。

1.2.6免疫组织化学法测定小鼠肺组织中tgf-β1、p-smad2及α-sma的表达将石蜡切片运用envision法，用0.01mtris-hcl修复液进行抗原修复。一抗工作液浓度：tgf-β1兔多克隆抗体、p-smad2、α-sma兔单克隆抗体1:100，二抗中杉金桥羊抗兔免疫组化试剂盒。dab显色，常规脱水、透明、中性树脂封片。将免疫组化染色后的所有切片在同一条件下进行拍照分析阳性染色细胞的分布和蛋白的表达情况。200倍光镜下每张切片随机选择5个视野，采用image-proplus6.0图像分析软件测定每个视野下测阳性反应的累积光密度值iod(sum)和area(samplesum)，测得平均光密度值＝iod(sum)/area(samplesum)。以5个视野的平均光密度值的平均值作为该例的测量值。光密度值越大表明目的蛋白表达水平越高。

1.2.6统计学处理采用统计软件spss17.0对同一时间点的实验数据进行单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1小鼠肺组织he染色及炎症评分如图1、2所示，n组小鼠各时间点肺泡结构清晰，肺泡间隔正常。m组小鼠在第7天肺泡结构破坏，炎性细胞浸润，肺泡间隔增宽，有少量红细胞渗出，有大量的巨噬细胞，肺泡炎症评分明显升高(p<0.05)；第21天肺泡炎症有所减轻，但仍有大量炎性细胞浸润。与m组相比，土槿乙酸组及阳性对照组吡非尼酮组小鼠肺泡结构破坏减轻，肺泡炎症程度减轻(p<0.05)。

2.2小鼠肺组织masson染色及评分模型组小鼠肺组织光镜下表现与对照组相比肺泡间质增宽，细胞外基质也明显增生，有大量染绿的胶原纤维增生沉积，形成广泛的纤维化；而土槿乙酸组及阳性对照组小鼠肺纤维化程度与模型组相比显著减轻；土槿乙酸组小鼠肺组织胶原纤维沉积与阳性对照组(吡非尼酮组)无统计学差异(图3，4)。

2.3土槿乙酸对纤维化小鼠血清il-6、tnf-α含量的影响模型组小鼠血清il-6、tnf-α含量与对照组相比显著增加(p<0.05)；土槿乙酸组血清il-6、tnf-α含量与模型组相比显著降低(p<0.05)。(图5、6)。以上的结果可以证明土槿乙酸能够有效的减轻小鼠炎症程度。

2.4土槿乙酸对纤维化小鼠肺组织iii型胶原mrna表达模型组小鼠肺组织的胶原ⅲ与对照组相比显著增高(p<0.05)；土槿乙酸组可以显著降低纤维化小鼠肺组织胶原ⅲ的表达。(图7、8)

2.5土槿乙酸对纤维化小鼠肺组织α-sma、tgf-β1、p-smad2含量的影响

模型组小鼠肺组织α-sma平均表达水平与对照组相比显著增加(p<0.05)；土槿乙酸组小鼠肺组织α-sma平均表达水平与模型组相比显著降低(p<0.05)；(图9,表1)

模型组小鼠肺组织tgf-β1、p-smad2平均表达水平与对照组相比显著增加(p<0.05)；土槿乙酸可以显著降低小鼠肺组织tgf-β1、p-smad2平均表达水平与模型组相比显著降低(p<0.05)。(图10、11；表2、3)

表1小鼠肺组织α-sma蛋白表达(n＝5，)

与n组比较，*p<0.05；与m组比较，#p<0.05，f＝11.058

表2肺组织tgf-β1蛋白表达(n＝5，)

与n组比较，*p<0.05；与m组比较，#p<0.05，f＝111.326

表3小鼠肺组织p-smad2蛋白表达(n＝5，)

与n组比较，*p<0.05；与m组比较，#p<0.05，f＝17.828

综上所述，土槿乙酸对小鼠肺纤维化具有明显的保护作用。其作用的机制可能与减少胶原的形成，减轻炎症反应，抑制tgf-β1、p-smad2的上调有关。

参考文献

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