本发明涉及一种水溶性银杏外种皮提取物及其制剂的制备方法，属于中药制药领域。
背景技术：
银杏是我国的珍贵树种，也是江苏省农业创汇的重要植物资源。为了更好地开发利用银杏资源，我们课题组最早从银杏的外种皮中提取具有抗肿瘤作用及用途的多糖类提取物，已经取得了一系列研究成果。然而，由于水溶性的问题，使银杏外种皮提取物的剂型选择受到了一定限制。我们曾在传统工艺（ZL00134363.7）的基础上进行了改进，改进后的工艺（ZL201010251068.9）虽然水溶性提高了，但工艺繁琐，制备时间较长，增加了成本。以改进水溶性为主要目标的工艺优化一直是本课题组的研究重点。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种水溶性银杏外种皮提取物及其制剂的制备方法。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的，一种水溶性银杏外种皮提取物的制备方法，包括以下步骤：
将被乙醇浸泡过的银杏外种皮置于煮提锅中常规加水煎煮 2 - 3 次并分别过滤，将滤液合并减压浓缩至比重在1.21-1.30；按溶液与容器以0.05-0.15（V/V）的比例将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度在1.5-2.5h达到60-80%（V/V），在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器，在20-30℃下以1400-1800rpm/min搅拌，静置后将沉淀物再用高浓度乙醇洗涤数次后冷冻干燥或真空干燥，得到水溶性银杏外种皮提取物。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，一种水溶性银杏外种皮提取物制剂的制备方法，将上述方法制备的水溶性银杏外种皮提取物加入赋型剂或矫味剂和防腐剂制成抗肿瘤胶囊制剂、片剂或口服液制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用连续磁力搅拌的方式将乙醇与浓缩液充分混匀，避免了手动搅拌混合不均的现象，从而得到粒径小、水溶性好、有效部位含量和抗肿瘤效价强度皆较高的银杏外种皮提取物。该方法设计科学可行，工序简单可控，适合工业化大生产。所得水溶性银杏外种皮提取物可制成胶囊、片剂和口服液制剂。
1、水溶性的测定
银杏外种皮粗提物在1.5%（W/V）浓度下肉眼观察完全溶解于水，而水溶性银杏外种皮提取物在3.0%（W/V）浓度下肉眼观察完全溶解于水，提示该方法制得的银杏外种皮提取物水溶性提高。
2、肽多糖含量的测定
采用苯酚硫酸法测多糖含量：精密称取无水葡萄糖标准品适量，用蒸馏水配成1mg/ml的葡萄糖标准液，再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml的葡萄糖标准溶液0.5ml于6支10ml具塞试管中，加入50mg/ml的重蒸酚溶液1ml，混合均匀后，加入5ml浓硫酸，混合均匀，沸水浴15min，冷水浴30min。用紫外分光光度计于490nm处测定吸光度，对葡萄糖溶液浓度和吸光度进行线性回归，建立回归方程。取供试品溶液0.5ml，按上述操作测吸光度值，代入回归方程，计算出多糖含量。
采用考马斯亮蓝法测蛋白质含量：精密称取牛血清白蛋白标准品适量，用蒸馏水配成100μg/ml的蛋白标准溶液，再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml蛋白标准溶液0.5ml分别于5支10ml具塞试管，再加入2.5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀后，放置5～10min，待其充分反应后，用紫外分光光度计于595nm处测定吸光度，对牛血清白蛋白溶液浓度和吸光度进行线性回归，建立回归方程。取供试品溶液0.5ml，按上述操作测吸光度值，代入回归方程，计算出蛋白质含量。
采用红外光谱分析仪进行定性分析。结果显示银杏外种皮提取物含酰胺键，提示为肽多糖。肽多糖含量%=(多糖含量+蛋白质含量)%。
采用该方法制备的银杏外种皮粗提物其多糖含量为36%、蛋白质含量为28%，所以肽多糖含量为36%+28%=64%。而水溶性银杏外种皮提取物其多糖含量为45%、蛋白质含量为31%，所以肽多糖含量为45%+31%=76%，提示水溶性银杏外种皮提取物抗肿瘤有效部位含量增加。
3、粒径测定
精密称取银杏外种皮粗提物和水溶性银杏外种皮提取物各2.5mg，分别溶于蒸馏水，定容至50 ml，得到浓度为50 μg/mL的GBEP水溶液。取该水溶液置于具塞试管中，超声20min后，采用马尔文激光粒度仪，测定粒径。结果显示，银杏外种皮粗提物的粒径为1.5-2.0μm，而采用该方法制得的水溶性银杏外种皮提取物粒径为150-200nm。
4、ζ电位测定
精密称取银杏外种皮粗提物和水溶性银杏外种皮提取物各2.5mg，分别溶于蒸馏水，定容至50 ml，得到浓度为50 μg/mL的GBEP水溶液。取该水溶液置于具塞试管中，超声20min后，采用马尔文激光粒度仪，测定ζ电位。结果显示，银杏外种皮粗提物ζ电位为(-14)-(-11) mV，而采用该方法制得的水溶性银杏外种皮提取物ζ电位为(-27)-(-25) mV，提示水溶性银杏外种皮提取物水溶液更稳定。
5、药效研究
取处于对数生长期的H22细胞，用胰蛋白酶消化、Hank’s液洗涤后，用含10%小牛血清RPMI1640培养液调整细胞至1×105/ml。向96孔培养板各孔中分别加入上述细胞悬液100μl，在5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养24h后，加入用含10%小牛血清RPMI1640培养液配制的不同浓度的样品各 100μl，每个浓度设6个复孔，培养48h。培养结束前4h加入MTT（终浓度5mg/ml），继续培养4h后弃去培养液，加入酸化异丙醇，振荡10min，用酶标仪于570nm处测定各孔的OD值。按公式“抑制率=(1-药物孔OD值/对照孔OD值)×100%”，计算体外对H22细胞增殖的抑制率。结果见表1。
表1 银杏外种皮提取物对H22肝癌细胞的抑制作用
表1结果显示，银杏外种皮提取物在10-320μg/ml剂量下对肝癌细胞具有直接抑制作用，随着剂量增加，其抑制作用也逐渐增强。而且，磁力搅拌所得水溶性银杏外种皮提取物的半数抑制浓度IC50（μg/ml）显著低于手动搅拌所得的银杏外种皮提取物，说明效价强度更高。
具体实施方式
实施例1
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮50克，加水800克，置于煮提锅中于98℃煎煮，每次1小时，共煎煮2次。将煎煮液合并，于70℃减压浓缩至比重为1.21，按0.05V/V的比例将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度在1.5h达到80%（V/V），在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器，在20℃下1800rpm/min搅拌，静置12小时后将沉淀物离心甩干，再用高浓度乙醇（体积浓度98%以上）洗涤2次后冷冻干燥，得到水溶性银杏外种皮提取物。制得的水溶性银杏外种皮提取物在3.0%（W/V）浓度下肉眼观察完全溶解于水，采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为45%及31%，肽多糖总含量为76%，粒径为121.4nm，ζ电位为-25.9mV。采用MTT法体外检测对H22细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入不同浓度的水溶性银杏外种皮提取物，继续培养48h检测。结果显示，水溶性银杏外种皮提取物终浓度在320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制H22肝癌细胞生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率（%）分别为78，73，61，48，36及23，半数抑制浓度IC50（μg/ml）为84.5。取水溶性银杏外种皮提取物干粉100g，加入赋型剂50g，拌匀，按每粒150mg装入空心胶囊，制成水溶性银杏外种皮提取物胶囊制剂。
实施例2
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮100克，加水2000克，置于煮提锅中于95℃煎煮，每次1小时，共煎煮3次。将煎煮液合并，于70℃减压浓缩至比重为1.26，按0.15V/V的比例将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度在2.5h达到60%（V/V），在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器，在30℃下以1400rpm/min搅拌，静置24小时后将沉淀物离心甩干，再用高浓度乙醇洗涤3次后冷冻干燥，得到水溶性银杏外种皮提取物。制得的水溶性银杏外种皮提取物在3.0%（W/V）浓度下肉眼观察完全溶解于水，采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为46%及23%，肽多糖总含量为69%，粒径为143.6nm，ζ电位为-25.0mV。采用MTT法体外检测对H22细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入不同浓度的水溶性银杏外种皮提取物，继续培养48h检测。结果显示，水溶性银杏外种皮提取物终浓度320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制H22肝癌细胞生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率（%）分别为76，70，59，46，33及21，半数抑制浓度IC50（μg/ml）为99.6。取水溶性银杏外种皮提取物干粉100g溶解于纯净水中，按药物质量要求加入适量矫味剂及防腐剂，摇匀，按10ml规格装瓶，制成水溶性银杏外种皮提取物口服液制剂。
实施例3
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮80克，加水1500克，置于煮提锅中于97℃煎煮，每次1小时，共煎煮2次。将煎煮液合并，于70℃减压浓缩至比重为1.30，按0.11V/V的比例将浓缩液转移至容器中，将容器置于磁力搅拌器的基座上，将乙醇缓慢滴加入浓缩液中，使乙醇终浓度在2.0h达到70%（V/V），在加入乙醇的同时开动磁力搅拌器，在25℃下以1600rpm/min搅拌，静置16小时后将沉淀物离心甩干，再用高浓度乙醇洗涤2次后真空干燥，得到水溶性银杏外种皮提取物。制得的水溶性银杏外种皮提取物在3.0%（W/V）浓度下肉眼观察完全溶解于水，采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为46%及25%，肽多糖总含量为71%，粒径为133.4nm，ζ电位为-25.2mV。采用MTT法体外检测对H22细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入不同浓度的水溶性银杏外种皮提取物，继续培养48h检测。结果显示，水溶性银杏外种皮提取物终浓度在320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制H22肝癌细胞生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率（%）分别为77，71，60，48，34及22，半数抑制浓度IC50（μg/ml）为92.0。取水溶性银杏外种皮提取物干粉150g，加入赋型剂50克，拌匀，按每片 100mg 制成片剂，此即水溶性银杏外种皮提取物片剂。