本发明涉及一种冬凌草提取物，具体的说是一种具有抗菌活性的冬凌草提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
自发现抗生素对动物生长有促进作用以后，抗生素饲料添加剂得到了广泛的应用，在畜牧业做出了巨大的贡献。但随着抗生素的滥用，抗生素饲料添加剂产生三方面的副作用：（1）、使病原菌产生耐药性；（2）、在机体内残留。影响人和动物的免疫效果；（3）、易产生致病菌的交叉感染。科学家们已证实：人类的许多疾病都与畜禽产品中的抗生素、激素及药物的残留有关。随着人们生活水平、健康意识的提高，绿色畜禽产品越来越受到广大人民的喜爱。饲料添加剂的安全性问题，始终是人们关注的热点。
1986年．瑞典全面禁止在畜禽饲料中使用抗生素．成为第一个不准使用抗生素作为生长促进剂的国家。2006年1月起，欧盟已全面禁止在动物饲料中添加抗生素。随后，日本和韩国等亚洲国家也相继制定了畜禽无抗生素饲养规范。2008年北京奥运会前后，我国在生物饲料和畜禽无抗生素养殖方面也得到了社会各界前所未有的重视。2015年，中国打响了“饲料禁抗”的第一枪，洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药开始全面禁止在动物中使用，随着形势的发展，未来必将会有更多的抗生素被禁止在动物饲料中添加使用。因此，开发安全、有效的绿色饲料添加剂是当前养殖业急需解决的问题。
冬凌草被称为冰凌草，学名碎米桠，是唇形科香茶菜属草本植物。冬凌草的活性成分主要包括萜类物质（二萜类、三萜类）和甾体类，黄酮类、挥发油类、氨基酸类、多糖、有机酸及其他类。
技术实现要素：
本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种具有抗菌活性的冬凌草提取物及其制备方法和应用，对多种微生物具有很强的抑制作用，可作为饲料添加剂的抗菌有效成份，预防饲料细菌性污染。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：
一种具有抗菌活性的冬凌草提取物，其成分包括冬凌草甲素、5,6,7三甲氧基黄酮、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、丁香酚、α-亚麻酸和雄烯二酮，各成分质量百分比含量为：冬凌草甲素10.17%，5,6,7三甲氧基黄酮16.46%，2-甲氧基-4-乙烯苯酚1.95%，丁香酚0.83%，α-亚麻酸0.67%，雄烯二酮2.79%；其对金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、嗜水气单胞菌和多杀性巴氏杆菌具有抑菌活性。
具有抗菌活性的冬凌草提取物可作为饲料添加剂的抗菌有效成份，预防饲料细菌性污染。
所述具有抗菌活性的冬凌草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）选择冬凌草地上部分，放入烘箱烘干，将杆和叶子分开，将选出的叶子经中药粉碎机粉碎，过60目筛放入真空玻璃干燥器中，得到干燥后冬凌草粉，备用；
（2）秤取上述步骤所准备的干燥后冬凌草粉，加入其质量6-10倍的体积分数为95%酒精水溶液，浸泡3-5天，每天搅拌3-4次，得到浸泡后冬凌草粉混合物；将浸泡后冬凌草粉混合物加入到回流装置中，把回流装置放入超声波发生器中进行超声乙醇回流提取，提取温度40℃、每次提取时间30 min、超声功率150 W，提取2次，合并两次滤液，备用；
（3）将上述步骤所得滤液用玻璃棒引流入布氏漏斗内，打开抽气泵开关，开始抽滤，过滤完之后先抽掉过滤瓶接管，后关抽气泵，将抽滤后滤液经45℃旋转蒸发仪浓缩制得浸膏，备用；
（4）将浸膏进行成分鉴定后，通过真空冷冻干燥进行干燥，通过粉碎机对干燥后浸膏进行粉碎，即制备出具有抗菌活性的冬凌草提取物。
步骤（4）中所述真空冷冻干燥步骤为：冷冻3-4h至温度降到﹣40℃，抽真空，最后等温度达到14-16℃，干燥48h。
步骤（4）中干燥后浸膏粉碎至130-160目。
步骤（4）中采用气质联用法对浸膏进行成分鉴定，将冬凌草提取物稀释成1mg/ml，色谱条件：进样温度300℃，程序升温：由80℃升至300℃保持8min,升温速率10℃/min；载气为高纯氦气，流速为1ml/min；分流比5:1，进样量1µL；EI电离谱70eV。
有益效果是：
1、本发明冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、嗜水气单胞菌、哈氏弧菌等常见易致病菌具有很强的抑制作用。作为“药食同源”的冬凌草是一种能够抑制有害微生物的良好资源，对开发我国的植物资源有极大的促进作用；以冬凌草提取物制备饲料添加剂，可作为天然饲料添加剂添加到饲料中来预防细菌性感染绿色、安全、无污染，符合当今畜牧业养殖无抗时代的要求，可作为饲料添加剂添加到饲料中预防禽类感染细菌疾病。
2、本发明冬凌草提取物的提取工艺，选用了合适的有机溶剂进行提取，从而可以有效地将抗菌成分提取出来。采取的是超声超声辅助乙醇回流提取，与普通的乙醇回流提取相比，提取效率更高。采用的是真空冷冻干燥器进行干燥，与常规的烘干、喷雾干燥、晒干等相比，真空冷冻干燥在低温下进行，能保持物料的营养成分，形状也能保持基本不变；冻干物料的含水率可以达到很低的程度，方便长期储存、长途运输；由于在冻结的状态下进行干燥，因此制品的体积、形状几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象；物料在低压下干燥，使物料中的易氧化成分不致氧化变质，同时因低压缺氧，能灭菌或抑制某些细菌的活力。
具体实施方式
一种具有抗菌活性的冬凌草提取物，其成分包括冬凌草甲素、5,6,7三甲氧基黄酮、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、丁香酚、α-亚麻酸和雄烯二酮，各成分质量百分比含量为：冬凌草甲素10.17%，5,6,7三甲氧基黄酮16.46%，2-甲氧基-4-乙烯苯酚1.95%，丁香酚0.83%，α-亚麻酸0.67%，雄烯二酮2.79%；其对金黄色葡萄球菌、哈氏弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、嗜水气单胞菌和多杀性巴氏杆菌具有抑菌活性。
具有抗菌活性的冬凌草提取物可作为饲料添加剂的抗菌有效成份，预防饲料细菌性污染。
所述具有抗菌活性的冬凌草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）选择冬凌草地上部分，放入烘箱烘干，将杆和叶子分开，将选出的叶子经中药粉碎机粉碎，过60目筛放入真空玻璃干燥器中，得到干燥后冬凌草粉，备用；
（2）秤取上述步骤所准备的干燥后冬凌草粉，加入其质量6-10倍的体积分数为95%酒精水溶液，浸泡3-5天，每天搅拌3-4次，得到浸泡后冬凌草粉混合物；将浸泡后冬凌草粉混合物加入到回流装置中，把回流装置放入超声波发生器中进行超声乙醇回流提取，提取温度40℃、每次提取时间30 min、超声功率150 W，提取2次，合并两次滤液，备用；
（5）将上述步骤所得滤液用玻璃棒引流入布氏漏斗内，打开抽气泵开关，开始抽滤，过滤完之后先抽掉过滤瓶接管，后关抽气泵，将抽滤后滤液经45℃旋转蒸发仪浓缩制得浸膏，备用；
（4）将浸膏进行成分鉴定后，通过真空冷冻干燥进行干燥，通过粉碎机对干燥后浸膏进行粉碎，即制备出具有抗菌活性的冬凌草提取物。
步骤（4）中所述真空冷冻干燥步骤为：冷冻3-4h至温度降到﹣40℃，抽真空，最后等温度达到14-16℃，干燥48h。
步骤（4）中干燥后浸膏粉碎至130-160目。
步骤（4）中采用气质联用法对浸膏进行成分鉴定，将冬凌草提取物稀释成1mg/ml，色谱条件：进样温度300℃，程序升温：由80℃升至300℃保持8min,升温速率10℃/min；载气为高纯氦气，流速为1ml/min；分流比5:1，进样量1µL；EI电离谱70eV。
实施例1
以冬凌草为原料，经干燥、粉碎、超声辅助乙醇回流提取、减压浓缩、真空冷冻干燥得到一种具有抗菌活性的冬凌草提取物，其制备方法如下：
（1）选择冬凌草叶子，采自河南省济源市，干燥后经中药粉碎机粉碎，过60目筛放入干燥器中备用。
（2）秤取上述冬凌草20g，加入6倍于冬凌草质量的95%酒精，浸泡3天，每天搅拌4次。把回流装置放入超声波发生器中进行超声乙醇回流提取，提取温度40℃、每次提取时间30 min、超声功率150 W，提取2次，合并两次滤液。
（3）滤液进行减压、抽滤，经45℃旋转蒸发仪浓缩制得浸膏。
（4）将浸膏通过真空冷冻干燥进行干燥，干燥后通过粉碎机进行粉碎至150目，即得一种具有抗菌活性的冬凌草提取物。
（5）采用气质联用法对冬凌草提取物进行成分鉴定，将冬凌草提取物稀释成1mg/ml，色谱条件：进样温度300℃，程序升温：由80℃升至300℃保持8min,升温速率10℃/min；载气为高纯氦气，流速为1ml/min；分流比5:1，进样量1µL；EI电离谱70eV。
实施例2
以冬凌草为原料，经干燥、粉碎、超声辅助乙醇回流提取、减压浓缩、真空冷冻干燥得到一种具有抗菌活性的冬凌草提取物，其制备方法如下：
（1）选择冬凌草叶子，采自河南省济源市，干燥后经中药粉碎机粉碎，过60目筛放入干燥器中备用。
（2）秤取上述冬凌草20g，加入8倍于冬凌草质量的95%酒精，浸泡5天，每天搅拌3次。把回流装置放入超声波发生器中进行超声乙醇回流提取，提取温度40℃、每次提取时间30 min、超声功率150 W，提取2次，合并两次滤液。
（3）滤液进行减压、抽滤，经45℃旋转蒸发仪浓缩制得浸膏。
（4）将浸膏通过真空冷冻干燥进行干燥，干燥后通过粉碎机进行粉碎至150目，即得一种具有抗菌活性的冬凌草提取物。
（5）采用气质联用法对冬凌草提取物进行成分鉴定，将冬凌草提取物稀释成1mg/ml，色谱条件：进样温度300℃，程序升温：由80℃升至300℃保持8min,升温速率10℃/min；载气为高纯氦气，流速为1ml/min；分流比5:1，进样量1µL；EI电离谱70eV。
实施例3
以冬凌草为原料，经干燥、粉碎、超声辅助乙醇回流提取、减压浓缩、真空冷冻干燥得到一种具有抗菌活性的冬凌草提取物，其制备方法如下：
（1）选择冬凌草叶子，采自河南省济源市，干燥后经中药粉碎机粉碎，过60目筛放入干燥器中备用。
（2）秤取上述冬凌草20g，加入10倍于冬凌草质量的95%酒精，浸泡4天，每天搅拌4次。把回流装置放入超声波发生器中进行超声乙醇回流提取，提取温度40℃、每次提取时间30 min、超声功率150 W，提取2次，合并两次滤液。
（3）滤液进行减压、抽滤，经45℃旋转蒸发仪浓缩制得浸膏。
（4）将浸膏通过真空冷冻干燥进行干燥，干燥后通过粉碎机进行粉碎至150目，即得一种具有抗菌活性的冬凌草提取物。
（5）采用气质联用法对冬凌草提取物进行成分鉴定，将冬凌草提取物稀释成1mg/ml，色谱条件：进样温度300℃，程序升温：由80℃升至300℃保持8min,升温速率10℃/min；载气为高纯氦气，流速为1ml/min；分流比5:1，进样量1µL；EI电离谱70eV。
药理试验例：冬凌草提取物的抑菌作用
1试验材料
1.1材料与试剂
冬凌草提取物，蛋白胨，氯化钠，大豆胨，琼脂粉，蒸馏水
1.2供试菌种
金黄色葡萄球菌（S.aureus），河南科技大学食品与生物工程学院实验教学中心保藏。
多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）、鼠伤寒沙门氏菌 （Salmonella typhimurium），购自中国微生物菌种保藏中心，经斜面培养活化后，4℃冰箱保存备用。
2试验方法
2.1抑菌试验
（1）含菌培养基制备
TSA培养基：蛋白胨15g，大豆胨5g，氯化钠5g，琼脂15~20g，水1000ml。121℃灭菌20min。
TSB培养基：蛋白胨15g，大豆胨5g，氯化钠5g，水1000ml。121℃灭菌20min。
灭菌吸管吸取用TSB培养基制备的菌悬液1mL加入100mL已融化并保温在水浴中（48～50℃）的TSA培养基内，使菌含量达到1×106cfu/mL，摇匀待用。
（2）抑菌试验
将上述制备好的含菌培养基倒入无菌培养皿中，静置冷却，等其凝固后，用无菌镊子将灭菌牛津杯垂直放在含菌培养基表面，轻轻按压（每个平板放4个牛津杯）。用移液器吸取100μL冬凌草提取物溶液，加入到牛津杯孔内，同时用甲醇做空白对照。然后，将培养皿放入培养箱中，细菌37℃培养15h后，真菌30℃培养48h后测量抑菌圈直径。
3结果与分析
冬凌草提取物的抑菌效果如表1。
表1 冬凌草提取物的抑菌效果
由表1可知，冬凌草提取物对金黄色葡萄球菌（S.aureus）、多杀性巴氏杆菌（P. multocida）、嗜水气单胞菌（A. hydrophila）、哈氏弧菌（V. harveyi）和鼠伤寒沙门氏菌 （S. typhimurium）具有一定的抑制作用，其中，金黄色葡萄球菌（S.aureus）和哈氏弧菌（V. harveyi）对冬凌草氯仿萃取物的抑菌圈直径达到20mm以上，达到很多抗菌药物的抑菌敏感标准。
成分分析试验例：气质联用分析
1试验方法
（1）选择冬凌草地上部分，采自河南省济源市，放入烘箱烘干，将杆和叶子分开，将选出的叶子经中药粉碎机粉碎，过60目筛放入真空玻璃干燥器中备用。
（2）秤取上述冬凌草，加入95%酒精，冬凌草与95%酒精比值为1:10（g/ml），浸泡3~5天，每天搅拌3~4次。把回流装置放入超声波发生器中进行超声乙醇回流提取，提取温度40℃、每次提取时间30 min、超声功率150 W，提取2次，合并两次滤液。
（3）将滤液用玻璃棒引流入布氏漏斗内，打开抽气泵开关，开始抽滤，过滤完之后先抽掉过滤瓶接管，后关抽气泵，将抽滤后滤液 经45℃旋转蒸发仪浓缩制得浸膏。
（4）采用液液萃取法，将提取物浸膏依次用石油醚、三氯甲烷进行萃取，对冬凌草提取物进行纯化。
（5）采用气质联用法对其抑菌活性成分进行成分鉴定，将冬凌草提取物氯仿相稀释成1mg/ml，色谱条件：进样温度300℃，程序升温：由80℃升至300℃保持8min,升温速率10℃/min；载气为高纯氦气，流速为1ml/min；分流比5:1，进样量1µL；EI电离谱70eV。
2试验结果与分析
冬凌草提取物的抑菌活性成分主要存在于氯仿相，主要成分有冬凌草甲素、5,6,7三甲氧基黄酮、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、丁香酚、α-亚麻酸、雄烯二酮。各成分含量为：冬凌草甲素10.17%；5,6,7三甲氧基黄酮16.46%；2-甲氧基-4-乙烯苯酚1.95%；丁香酚0.83%；α-亚麻酸0.67%，雄烯二酮2.79%。