本发明涉及一种植物源广谱抗菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
防腐剂是指可以阻止微生物生长的物质。在化妆品中，防腐剂的作用是保护产品，使之免受微生物污染。目前常用的防腐剂多为合成防腐剂，例如乙内酰脲(dmdmh)、卡松系列、布罗波尔、碘代丙炔基氨基甲酸丁酯(ipbc)、尼泊金酯类、三氯新等。这些防腐剂均存在一定缺陷：例如，dmdmh在使用过程中易释放甲醇，存在安全隐患；卡松系列因含氯成分，使用过程中可能对某些肤质产生一定的刺激性；布罗波尔易产生致癌物质亚硝胺；ipbc可能导致使用者碘的过量摄入；尼泊金酯类易在脂肪组织中产生累积；三氯新已被证实会对环境产生负面影响；此外对羟基苯甲酸防腐剂类在特定的测试系统中已经证实能显示某种模拟女性激素雌激素的能力，对人体安全和生理系统带来不良影响。可见，市场上亟需出现一种低毒、高效、无污染的天然防腐剂。
近年来，在回归自然、享受绿色与健康的热潮冲击下，化妆品中加入纯天然的防腐剂已成为国内外提倡和开发的热点，从天然产物提取分离出抗菌性强而广、安全无毒的天然防腐剂已成为今后开发的重要方向。
而目前使用的天然防腐剂多为粗制品，其颜色较深，气味较浓，抗菌谱也较窄。同时，有些中药联合使用后抗菌效果不如单味药，如黄芪和黄芩混合配比后对大肠杆菌、绿脓杆菌和沙门氏杆菌的抑菌作用弱于单独使用。因此，开发一种原料天然、能广谱抗菌的抗菌剂是本领域亟待解决的技术难题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中存在的天然防腐剂抗菌谱较窄的缺陷，而提供了一种植物源广谱抗菌剂及其制备方法和应用。本发明提供的植物源广谱抗菌剂具有广谱抗菌、温和、溶解性好、经济、用量小、稳定及适合工业化生产的优点，可以有效抑制化妆品中微生物的生长，延长化妆品的货架寿命，同时有利于保障产品的安全性，防止消费者因使用受微生物污染的产品而引起可能的感染。本发明提供的制备方法克服了传统制备工艺制备的中药提取液气味重，有效成分保留少，杂质多，抗菌谱窄、用量大、刺激性强等问题。
本发明是采用如下技术方案来解决上述技术问题的：
本发明提供了一种植物源广谱抗菌剂的制备方法，所述的植物源广谱抗菌剂的原料包括物料a、水、脂肪酶和ph调节剂，以质量份数为100份计，所述物料a包括以下组分：0.1～5份的山苍子油、0.1～5份的广藿香油、0.1～5份的香茅油、0.1～5份的水解人参皂苷和80～99.6份的辛酸癸酸甘油三酯；所述的制备方法包括如下步骤：
(1)将所述物料a中的各组分混合均匀，得油脂混合物；
(2)将水与脂肪酶混合均匀，再调节ph值至7～10，再与所述油脂混合物混合均匀，在40～50℃下酶解，酶解过程中伴以搅拌，得酶解液；
(3)对所述酶解液进行超声处理，然后进行油水分离，取油相；
(4)对所述油相进行陈化处理，取上清液过滤，得滤液，即可。
本发明中，以质量份数为100份计，所述物料a较佳地包括以下组分：0.2～1份的山苍子油、0.2～1份的广藿香油、0.2～1份的香茅油、0.2～1份的水解人参皂苷和96～99.2份的辛酸癸酸甘油三酯。
其中，所述的山苍子油具有本领域常规含义，其来源于樟木科植物，山鸡椒的果实，较佳地购自吉安国光香料厂。
其中，所述的广藿香油具有本领域常规含义，其来源于唇形科植物广藿香草的地上部分，较佳地购自吉安市万亿香料油有限公司。
其中，所述的香茅油具有本领域常规含义，其来源于禾本科香茅属植物香茅草的全草，较佳地购自吉安市万亿香料油有限公司。
其中，所述的水解人参皂苷具有本领域常规含义，其来源于五加科植物人参的根茎叶中人参皂苷的水解产物，较佳地购自西安萃源生物科技有限公司。
其中，所述的辛酸癸酸甘油三酯具有本领域常规含义，其来源于棕榈科植物油棕的果实，为棕榈油精制后的衍生物，较佳地购自上海赛福化工发展有限公司。
本发明中，所述的水为本领域常规物质，较佳地为去离子水，所述的去离子水的用量为本领域常规用量，较佳地为所述物料a的用量的1/10～1/5。
本发明中，所述的ph调节剂为本领域常规物质，较佳地为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、盐酸和柠檬酸中的一种或多种。
步骤(2)中，所述的脂肪酶为本领域常规物质，较佳地购自庄市杰诺生物酶有限公司；所述的脂肪酶的用量为将溶液中的酶活性调节至常规酶解反应所需要的酶活性，较佳地为将酶活性调节至10～500u/g所需的脂肪酶的用量，更佳地为将酶活性调节至50～100u/g所需的脂肪酶的用量。
步骤(2)中，所述的酶解的时间为本领域常规的酶解时间，一般为1小时以上，较佳地为1～4小时。
步骤(2)中，所述的搅拌为本领域常规操作，所述的搅拌的速率较佳地为100～300rpm，更佳地为200rpm。
步骤(3)中，所述的超声为本领域常规操作，所述的超声的频率较佳地为25000～35000hz，更佳地为30000hz；所述的超声的时间较佳地为2～10分钟。
步骤(3)中，所述的油水分离可以采用本领域常规操作实现，较佳地为静置。所述的静置的时间为本领域常规，较佳地为0.5～4h。
步骤(4)中，所述的陈化为本领域常规操作，所述的陈化的温度较佳地为-6℃～-2℃，更佳地为-4℃；所述的陈化的时间较佳地为8～14小时，更佳地为12小时。
本发明还提供了一种由上述制备方法制得的植物源广谱抗菌剂。
本发明中，所述的植物源广谱抗菌剂具有广谱抗菌性能，其能抵抗的菌的种类较佳地包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌中的一种或多种。
本发明还提供上述植物源广谱抗菌剂在日用化妆品和/或皮肤外用药物中作为防腐剂的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明通过应用植物间的配伍关系及协同作用，使提取物具有广谱抗菌的作用，并且在原料中引入了水解人参皂苷，使抗菌剂的安全性得到很大提高；
(2)本发明在传统中药制剂的制备过程中融入了现代生物酶解技术，明显降低了刺激性，大大提高了植物抗菌剂的抗菌活性，同时改良了不良气味对抗菌剂应用的影响；通过陈化除去部分杂质，从而更好地保留小分子物质，在满足化妆品使用要求和美感上有重要贡献；
(3)本发明中整个工艺过程都是以植物油脂及提取物为原料，在低温条件下制备，绿色天然，节能环保；
(4)本发明制得的抗菌剂能与二丙二醇以任意比例互溶，由于使用量较低，为称量方便，可以用二丙二醇进行稀释。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所使用的山苍子油购自吉安国光香料厂，广藿香油购自吉安市万亿香料油有限公司，香茅油购自吉安市万亿香料油有限公司，水解人参皂苷购自西安萃源生物科技有限公司，辛酸葵酸甘油三酯购自上海赛福化工发展有限公司，脂肪酶购自枣庄市杰诺生物酶有限公司。
实施例1(抗菌剂)
本实施例中植物源广谱抗菌剂的制备方法如下：
(1)将0.1g山苍子油、0.1g广藿香油、0.1g香茅油、0.1g水解人参皂苷和99.6g辛酸癸酸甘油三酯充分混合均匀，得油脂混合物；
(2)取10g去离子水，加入脂肪酶，至酶活性为50u/g，使用碳酸氢钠调节ph值至8，与步骤(1)中的油脂混合物混合均匀，在40℃条件下酶解2h，酶解过程中伴以搅拌，搅拌速率为100rpm；
(3)停止搅拌，在30000hz条件下超声2分钟，再静置30分钟进行油水分离，取油相；
(4)将油相在-4℃下陈化12小时，取上清液过滤，即得所述植物源广谱抗菌剂。
实施例2(抗菌剂)
本实施例中植物源广谱抗菌剂的制备方法如下：
(1)将1g山苍子油、1g广藿香油、1g香茅油、1g水解人参皂苷和96g辛酸癸酸甘油三酯充分混合均匀，得油脂混合物；
(2)取10g去离子水，加入脂肪酶，至酶活性为100u/g，使用碳酸钠调节ph值至9，与步骤(1)中的油脂混合物混合均匀，在45℃条件下酶解4h，酶解过程中伴以搅拌，搅拌速率为200rpm；
(3)停止搅拌，在30000hz条件下超声5分钟，再静置1h进行油水分离，取油相；
(4)将油相在-4℃下陈化12小时，取上清液过滤，即得所述植物源广谱抗菌剂。
实施例3(抗菌剂)
本实施例中植物源广谱抗菌剂的制备方法如下：
(1)将5g山苍子油、5g广藿香油、5g香茅油、5g水解人参皂苷和80g辛酸癸酸甘油三酯充分混合均匀，得油脂混合物；
(2)取20g去离子水，加入脂肪酶，至酶活性为10u/g，使用柠檬酸调节ph值至7，与步骤(1)中的油脂混合物混合均匀，在50℃条件下酶解4h，酶解过程中伴以搅拌，搅拌速率为300rpm；
(3)停止搅拌，在25000hz条件下超声10分钟，再静置4h进行油水分离，取油相；
(4)将油相在-6℃下陈化8小时，取上清液过滤，即得所述植物源广谱抗菌剂。
实施例4(抗菌剂)
本实施例中植物源广谱抗菌剂的制备方法如下：
(1)将0.2g山苍子油、0.2g广藿香油、0.2g香茅油、0.2g水解人参皂苷和99.2g辛酸癸酸甘油三酯充分混合均匀，得油脂混合物；
(2)取10g去离子水，加入脂肪酶，至酶活性为500u/g，使用氢氧化钠调节ph值至10，与步骤(1)中的油脂混合物混合均匀，在45℃条件下酶解4h，酶解过程中伴以搅拌，搅拌速率为200rpm；
(3)停止搅拌，在35000hz条件下超声5分钟，再静置1h进行油水分离，取油相；
(4)将油相在-2℃下陈化14小时，取上清液过滤，即得所述植物源广谱抗菌剂。
对比实施例1(不采用生物酶解技术的抗菌剂的对比实施例)
本对比实施例中抗菌剂的制备方法如下：
(1)将1g山苍子油，1g广藿香油，1g香茅油，1g水解人参皂苷，96g辛酸癸酸甘油三酯，充分混合均匀；
(2)在-10℃下陈化12小时，过滤，即得所述植物源防腐剂。
对比实施例2(原料中不加水解人参皂苷的抗菌剂的对比实施例)
本对比实施例中抗菌剂的制备方法如下：
(1)将1g山苍子油，1g广藿香油，1g香茅油，97g辛酸癸酸甘油三酯，充分混合均匀；
(2)取10g去离子水，加入脂肪酶，至酶活性为100u/g，调节ph值至9，与步骤(1)中的油脂混合，在45℃条件下，搅拌4h；
(3)停止搅拌，在30000赫兹条件下，超声5分钟，静置1h，进行油水分离，取油相；
(4)在-10℃下陈化12小时，过滤，即得所述植物源防腐剂。
效果实施例1(抗菌剂的抑菌试验)
抑菌试验步骤：
(1)试验菌株
金黄色葡萄球菌(atcc8739)，大肠杆菌(atcc6538)，绿脓杆菌(atcc9027)，白色念珠球菌(atcc10231)，黑曲霉菌(atcc16404)。
(2)培养基
tsb固体培养基：蛋白胨10g/l，nacl10g/l，k2hpo42.5g/l，酵母提取物3g/l，琼脂15g/l，蒸馏水溶解，调节ph为7.2±0.2，115℃高压灭菌20min；tsb液体培养基：蛋白胨10g/l，nacl10g/l，k2hpo42.5g/l，酵母提取物3g/l，蒸馏水溶解，调节ph为7.2±0.2，115℃高压灭菌20min；
sdb固体培养基：蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，k2hpo43g/l，酵母提取物5g/l，琼脂15g/l，蒸馏水溶解，115℃高压灭菌20min；sdb液体培养基：蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，k2hpo43g/l，酵母提取物5g/l，蒸馏水溶解，115℃高压灭菌20min。
(3)菌悬液制备及接种
取甘油保藏的金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌100μl涂布于tsb固体培养基上，37℃培养2d，用生理盐水重悬，得到菌悬液，并用平板培养法计数，将测试菌浓度调整为105～106cfu/ml。
白色念珠球菌和黑曲霉菌100μl涂布于sdb固体培养基上，30℃培养2d，用生理盐水重悬，得到菌悬液，并用平板培养法计数，将测试菌浓度调整为105～106。
(4)样品抑菌作用的测定
杯碟法
在培养皿中倒入tsb或sdb固体培养基，待凝固后，在此培养基上均匀涂布测试菌100μl。在培养基上等距离放2个无菌牛津杯[内径(6.0±0.1)mm，外径(8.0±0.1)mm，高(10.0±0.1)mm，在杯内分别注入200μl待测样品，用生理盐水或含一定量的dmso的生理盐水作为对照。37℃或30℃恒温箱中培养2d后，用直尺测量各种药品的抑菌圈直径，取其平均值。
微孔板法
在微孔中加入100μl待测样品(初始浓度)，再加入含测试菌浓度1.0×105cfu/ml为2×tsb或2×sdb液体培养基100μl，混匀，即待测样品的测试浓度为初始浓度的50wt％。30℃或37℃恒温箱中培养2d后，观察有无菌生长。结果判断的前提是生长对照良好，空白对照无菌生长清晰。
(5)最低抑菌浓度(mic值)的测定
①最低抑制金黄色葡萄球菌浓度(mic)、最低抑制大肠杆菌浓度(mic)、最低抑制绿脓杆菌浓度(mic)、最低抑制白色念珠球菌浓度(mic)的测定方法如下：
药液制备：将待测样品用生理盐水稀释成实验浓度。
菌液制备：用2×tsb或2×sdb液体培养基稀释菌悬液，使其最终菌浓度为l05cfu/ml。
培养及结果判读：在微孔中加入菌液100μl和药液100μl，同时设不加菌的阴性对照和不加药液的正常生长对照，每种药做3个平行，取平均值。置37℃或30℃湿盒孵育，48h后观察结果，采用直接法读取数据。结果判断的前提是生长对照良好，空白对照无菌生长清晰，其它孔随药物浓度梯度升高而菌的生长受到抑制。
②最低抑制黑曲霉浓度(mic)测定
采用杯碟法，在培养皿中倒入sdb固体培养基，待凝固后，在此培养基上加入黑曲霉菌(105cfu/ml)100μl，均匀涂布。在培养基上等距离放3个无菌牛津杯[内径(6.0±0.1)mm，外径(8.0±0.1)mm，高(10.0±0.1)mm，在杯内分别注入200μl不同浓度的样品(用生理盐水稀释)。同时设不加测试样品的正常生长对照和生理盐水对照。结果判断的前提是生长对照和生理盐水对照生长良好，其它随药物浓度梯度升高而菌的生长受到抑制。
本发明与单味植物油(植物油用辛酸癸酸甘油三酯稀释成3％的溶液)，以及水解过程可能产生的已知具有一定防腐效果的单辛酸癸酸甘油酯相比，产品抑菌结果如表1所示：
表1实施例与单味植物油的mic值比较
由表1可知，在100μl/ml以内，山苍子油对大肠杆菌、黑曲霉无抗菌效果，对白色念珠菌、绿脓杆菌抗菌效果一般；在100μl/ml以内广藿香对绿脓杆菌无抗菌效果，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抗菌效果一般；在100μl/ml以内，香茅油对大肠杆菌、绿脓杆菌无抗菌效果，对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉的抗菌效果一般，单辛酸甘油酯对绿脓杆菌、黑曲霉抗菌效果一般，单癸酸甘油酯对绿脓杆菌和白色念珠菌抗菌效果一般。
本发明实施例与对比实施例的抑菌结果比较如表2所示：
表2实施例与对比实施例的mic值比较
由表2可知对比实施例1对各菌的抑制效果均一般，对比实施例2与实施例2的抑菌效果相当。
由此可见：一、通过植物之间的合理配伍，起到广谱抗菌的效果；二、针对每个菌单独来看，配伍后的抑菌效果优于单味植物的抗菌效果，实现了1+1大于2的结果，体现了植物之间抗菌效果上的协同作用；三、酶解后的综合产物，优于其可能产生的单一成分的抑菌效果；四、酶解后能够大幅度提高抑菌效果。
本发明的组方抑菌功效显著，具有广谱的抗菌功效，其抑菌效果要好于单味药的效果，克服了单味药对某些菌株的局限性。同时，此发明的三种中药的比例可以最大限度的抑制细菌的增长。适合作为植物防腐剂使用，工艺方案保持了抑菌功效，并大幅减弱了产品的颜色，产品稳定，适合添加到化妆品中作为防腐剂使用。
为进一步说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，下面的实施例中将对本发明作进一步的说明，在实施例中申请人特意加了易滋生微生物的胶原蛋白和葡萄糖来有效说本工艺下植物防腐剂的使用效果，实施例不以任何方式限制本发明。所有材料均为质量百分比浓度。
实施例5(本发明实施例1制备的抗菌剂作为防腐剂在霜类产品中的应用)
本实施例的霜类产品可作为保湿霜、修复霜等使用，其原料配方如下：
本实施例的霜类产品的制备工艺如下：
(1)取甘油，加水相釜中，加入透明质酸钠、聚丙烯酸钠，搅拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二钠加入该釜中，加热至温度为85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取辛酸硅酸甘油三酯、山嵛醇、ve醋酸酯、emulgadesucro(emulgadesucro为商品名，其具体物质为蔗糖多硬脂酸酯和氢化聚异丁烯)、植物甾醇放至油相釜中，加热至温度为85℃，搅拌为300rpm，即得油相。
(3)将(2)油相与(1)水相在乳化釜中混合，均质(速度为500rpm)5min，搅拌降温至45℃。
(4)取本发明实施例1得抗菌剂、胶原蛋白、葡萄糖、1,2-辛二醇加至(3)中，搅拌速度为500rpm，降至室温。
实施例6(本发明实施例2制备的抗菌剂作为防腐剂在霜类产品中的应用)
本实施例的霜类产品可作为保湿霜、修复霜等使用，其原料配方如下：
本实施例的霜类产品的制备工艺如下：
(1)取甘油，加水相釜中，加入透明质酸钠、聚丙烯酸钠，搅拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二钠加入该釜中，加热至温度为85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取辛酸硅酸甘油三酯、山嵛醇、ve醋酸酯、emulgadesucro、植物甾醇放至油相釜中，加热至温度为85℃，搅拌为300rpm，即得油相。
(3)将(2)油相与(1)水相在乳化釜中混合，均质(速度为500rpm)5min，搅拌降温至45℃。
(4)取本发明实施例2得天然抗菌剂、胶原蛋白、葡萄糖、1,2-辛二醇加至(3)中，搅拌速度为500rpm，降至室温。
实施例7(本发明实施例1制备的抗菌剂作为防腐剂在水类产品中的应用)
本实施例的水类产品可作为润肤水、保湿水、精华水等使用，其原料配方如下：
本实施例的水类产品的制备工艺如下：
(1)取甘油、丁二醇，加水相釜中，加入透明质酸钠，搅拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二钠加入该釜中，加热至温度为85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取本发明实施例1得天然抗菌剂、peg-40氢化蓖麻油、1,2-辛二醇、1,2-戊二醇放油相釜中，搅拌均匀，加热至温度为85℃，即得油相。
(3)将(2)油相加入(1)水相，快速搅拌(速度为300rpm)5min，搅拌降温至45℃。
(4)取胶原蛋白和葡萄糖加至(3)中，搅拌速度为300rpm，降至室温。
对比实施例3(本发明对比实施例1制备的抗菌剂作为防腐剂在霜类产品中的应用)
本对比实施例的霜类产品可作为保湿霜、修复霜等使用，其原料配方如下：
本对比实施例的霜类产品的制备工艺如下：
(1)取甘油，加水相釜中，加入透明质酸钠、聚丙烯酸钠，搅拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二钠加入该釜中，加热至温度为85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取辛酸硅酸甘油三酯、山嵛醇、ve醋酸酯、emulgadesucro、植物甾醇放至油相釜中，加热至温度为85℃，搅拌为300rpm，即得油相。
(3)将(2)油相与(1)水相在乳化釜中混合，均质(速度为500rpm)5min，搅拌降温至45℃。
(4)取本发明对比实施例1得天然抗菌剂、胶原蛋白、葡萄糖、1,2-辛二醇加至(3)中，搅拌速度为500rpm，降至室温。
对比实施例4(本发明对比实施例2制备的抗菌剂作为防腐剂在霜类产品中的应用)
本对比实施例的霜类产品可作为保湿霜、修复霜等使用，其原料配方如下：
本对比实施例的霜类产品的制备工艺如下：
(1)取甘油，加水相釜中，加入透明质酸钠、聚丙烯酸钠，搅拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二钠加入该釜中，加热至温度为85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取辛酸硅酸甘油三酯、山嵛醇、ve醋酸酯、emulgadesucro、植物甾醇放至油相釜中，加热至温度为85℃，搅拌为300rpm，即得油相。
(3)将(2)油相与(1)水相在乳化釜中混合，均质(速度为500rpm)5min，搅拌降温至45℃。
(4)取本发明对比实施例2得天然抗菌剂、胶原蛋白、葡萄糖、1,2-辛二醇加至(3)中，搅拌速度为500rpm，降至室温。
对比实施例5(本领域常规的水类产品)
本对比实施例的水类产品可作为润肤水、保湿水、精华水等使用，其原料配方如下：
本对比实施例的水类产品的制备工艺如下：
(1)取甘油，加水相釜中，加入透明质酸钠、聚丙烯酸钠，搅拌300rpm，取水和乙二胺四乙酸二钠加入该釜中，加热至温度为85℃，溶解至澄清，得水相。
(2)取辛酸硅酸甘油三酯、山嵛醇、ve醋酸酯、emulgadesucro、植物甾醇放至油相釜中，加热至温度为85℃，搅拌为300rpm，即得油相。
(3)将(2)油相与(1)水相在乳化釜中混合，均质(速度为500rpm)5min，搅拌降温至45℃。
(4)取本发明单癸酸甘油酯、胶原蛋白、葡萄糖、1,2-辛二醇加至(3)中，搅拌速度为500rpm，降至室温。
效果实施例2(实施例5～7、对比实施例3～5的防腐挑战试验)
(1)防腐挑战接种的方式和数量：
采用混合菌接种。待测样品中接入金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌至接种数量为105～106cfu/g或105～106cfu/ml；白色念珠球菌和黑曲霉菌接种数量为104cfu/g或104cfu/ml，各三个平行，以生理盐水作为空白对照。
(2)防腐挑战分离检测
接种后的样品在特定时间分离检测：0小时、7天、14天、21天和28天。取样后，根据实验需要，用生理盐水稀释后取100μl涂布于tsb和sdb培养基平板，28℃±1℃或36℃±1℃培养后菌落计数。
(3)评判标准(按照化妆品和香料香精协会(ctfa)标准)
要求在第7天时，细菌降低99.9％，黑曲霉菌和白色念珠球菌各降低90％，并且在28天内持续下降，则通过防腐挑战试验。
如果混合菌接种的三个平行试验中任何一个微生物数量的平均值，在第7天时下降到100cfu/g(cfu/ml)以下，在28天内全部降至0cfu/g(cfu/ml)或＜10cfu/g(cfu/ml)，那么视为防腐效果优秀。
表30小时防腐挑战结果
表448小时防腐挑战结果
表57天防腐挑战结果
表614天防腐挑战结果
表721天防腐挑战结果
表828天防腐挑战结果
表9防腐挑战结果汇总
效果实施例3(实施例5～7、对比实施例4的人体皮肤斑贴试验)
(1)斑试方法：选用合格的斑试器，以封闭式斑贴试验方法，将受试物约0.020g～0.025g涂于斑试器内，外用专用胶带贴敷于受试者前臂曲侧，24小时后去除受试物，于去除受试物斑试器后30min，待压痕消失后观察皮肤反应，按《化妆品卫生规范》(2007年版)中皮肤反应分组标准记录其结果。
(2)结果评价：按表10(皮肤不良反应分组标准)记录反应结果，具体结果见表11。
表10皮肤不良反应分组标准
表11实施例样品对人体皮肤斑贴试验结果
结论：各组的人体皮肤斑贴试验结果显示：在3个实施例中30例受试者皮肤全部呈阴性反应，而对比实施例4，有7例为可疑反应，仅有微弱红斑(评分等级：0级)。依据《化妆品卫生规范》(2007年版)人体皮肤斑贴试验判断标准3组实施例对人体无皮肤不良反应，而对比实施例4为可疑反应，说明本发明的原料中加入水解人参皂苷带来的意义，即能大大提高防腐剂的安全性。